Das Knock-out Tier

Eine knock-out-Maus (englisch: k.o.; kaputt schlagen) ist eine Maus bei der mittels einer genetischen Manipulation gezielt ein Gen inaktiviert wurde. Diese Manipulation geschieht an den embryonalen Stammzellen (von Mäusen), die dann in die Keimbahn einer Maus eingebracht werden.

Mit Hilfe der genetisch veränderten Tiere können beispielsweise biologische Mechanismen untersucht werden. Außerdem eignen sie sich als Modelle für menschliche Erkrankungen oder für pharmakologische Fragestellungen

Funktionen eines Gens untersuchen: Sucht Tier mit Mutationen (Basenveränderungen) in diesem Gen und vergleicht solche Tiere mit Tieren, die diese Mutation nicht besietzen.

Problem: man kann nie ganz ausschliessen, das Unterschiede z.T. auch auf andere Gene zurückzuführen sind, in denen sich Tiere zwangsläufig unterscheiden.

Mutanten eines Gens sind oft schwer zu finden und zu identifizieren: Bei tiere die sich schnell Verpaaren (Drosophila) ist es leicht durch zB Bestrahlung Mutanten zu erzeugen und zu untersuchen. Bei Säugetiere ist es schwer, weil die Nachkommenzahl gering ist->ist auf den Zufall angewiesen, dass man Mutation entdeckt

Cystein Fibrose beim Mensch: Mäuse mit ähnlicher Krankheit sind schwer zu finden und Mutation ist bei Mäusen selten. -> Dank gezielt bestimmte Genen von Mäuse zu mutieren kann man Krankheitsmodelle herstellen

Reverse Genetik: heutige transgene Technologie und Gene Targeting beidem gezilt Allele ausgetauscht werden, eröffnen neue Möglichkeiten, Tiere mit gezielten Veränderungen in einem Gen herzustellen und als wichtige Modelle für das Studium von Erkrankungen zu nutzen = reverse Genetik.

Dieselbe Techniken wie für die Herstellung transgener Tiere. ->Knock-out Tiere sind im weiten Sinne auch transgene Tiere.

Knock-out Mäuse: definierter DNA-Abschnitt eines Chromosoms wird zielgerichtet ausgetauscht und dadurch die Genexpression inaktiviert =knock-out Mutation.

Homologe Rekombination:

In diesem Verfahren wird das DNA Konstrukt derart konzipiert, dass die homologen Sequenzen zum Promotor und Exon 1 eines bestimmten Genes x den neo+ Marker flankieren. ->Der natürliche Promotor geht bei der homologen Rekombination somit verloren.

homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis:

-Vorgang kann durch einen Marker (neo+ ) selektioniert werden. Bei der gezielten Integration wird aber der zweite Marker (HSV-tk) nicht mitintegriert (da er sich ausserhalb der homologen Sequenzen befindet). ->erlaubt Forscher dieses Ereignis von einer zufällige Integration zu unterscheiden:

*Zellen, bei denen das Transgen zufällig integriert wurde, sind neo und tk resistent.

*Zellen, bei denen das Transgen gezielt integriert wurde, sind jedoch nur neo (aber nicht tk) resistent.

Meistens wird die Integration an den richtigen Ort noch mittels PCR nachgeprüft (ein Primer ausserhalb und ein Primer innerhalb des Konstruktes).



Verlust des Promotors: Gen x kann nicht mehr transkribiert werden->wird nur noch ein Allel exprimiert.

Eine solche Zelle wird wie bei der Generation eines transgenen Tieres in die Blastozyste injiziert und anschliesend einer Ammenmutter implantier. Nach Rückkreuzung mit einem wildtyp Tier (+/+) kann ein Tier etabliert werden, das heterozygot diesen Gendefekt trägt (+/-).

• Durch weitere Kreuzung wird ein homozygotes Tier generiert, das den neo Marker auf beiden Allelen trägt-> knock-out Maus (-/-) (für Gen x), da sie nicht mehr in der Lage ist, das entsprechende Genprodukt x zu synthetisieren.
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Ist Gen x für die Entwicklung des Tieres absolut notwendig, wird man nie eine Maus erhalten, die bezüglich des integrierten Markers homozygot ist.

Embryonen sterben dann meistens ab.

Manchmal hat das Ausschalten eines Gens allerdings nur sehr geringe bis gar keine phänotypische Auswirkungen auf den Organismus. In solchen Fällen ist ein anderes Gen in der Lage, das ausgeschaltete Gen - den Knock-out - zu kompensieren.

Die Methode ist immer noch sehr arbeits- und zeitaufwendig und setzt genaue Kenntnisse der zu mutierenden Gene voraus. Durch knock-out Mutationen wurden trotzdem in den letzten Jahren viele Genfunktionen aufgeklärt.

Findet oft Proteine, wo man die Funktion nicht kennen->mit Knock-out Tier will man Hinweis Proteinfunktion durch Veränderung deren Phänotyp finden

Wir besprechen

-Erforschung von biologischen Mechanismen

-Tiere als Modelle von menschlichen Krankheiten

Chronobiologie: knock-out Mäuse werden benutzt, um die molekularen Mechanismen die hinter der circadianen Rhythmik stehen zu verstehen.

Die Frage dabei ist, welchen Platz die Gene, die ausgeschaltet wurden und damit die von ihnen produzierten Eiweiße bei der Regulation der circadianen Rhythmik einnehmen.

Beispielsweise haben wir in unserer eigenen Forschung den Einfluss der ADP-Ribosyltransferase ARTD1 (PARP1) auf die circadiane Rhythmik in der Maus untersucht (Figur 73).

Es gibt nicht für alle humane Erkrankungen ein repräsentatives Modell. Trotzdem sind Tiermodelle in der medizinischen Forschung von großer Bedeutung->Ursachen Krankheiten bei Menschen oft eine gestörte Genfunktion.

Viele Modelle genetisch bedingter Erkrankungen wurden über spontane Mutationen (Mutationen, die ohne gezielte äußere Einwirkung entstehen) etabliert. Zum Beispiel: NOD-Maus.

NOD-Maus: leidet an Diabetes und dient als Modell für den menschlichen insulinabhängigen Diabetes mellitus. ->Um Mutationen bei Tieren hervorzurufen, setzt man den Organismus z. B hohen Dosen chemischer (mutagener) Substanzen oder radioaktiver Belastung aus. Kann so verschiedene Linien erstellen. Da aber mit dieser Methode Mutationen zufällig erzeugt werden, gestaltet sich die Auswertung der erzeugten Veränderungen und die Zuordnung zu eventuellen Krankheitsbildern sehr aufwendig.

knock-out Mäuse sind im Gegensatz dazu ein ideales Krankheitsmodell:

-Kann durch die «Herstellung» solcher Tiere mögliche Aussafen Aussagen über die Rolle bestimmter Gene bei Krankheiten und ihren Behandlungen machen.

-kann die genetischen Grundlagen als auch die Therapiemöglichkeiten an ihnen genau studieren.

->bereits unterschiedliche Modelle für wichtige humane Erkrankungen, darunter viele genetisch bedingte Krankheiten, einige Krebsarten und Autoimmunkrankheiten sowie Erkrankungen, die auf infektiöse Erreger zurückzuführen sind.