Transgene Tiere: Fakten und Perspektiven

In befruchtete Eizelle wird fremdes Transgen eingeschleust. Fremdes DNA-Konstrukt ist ein Transgen.-->Individuen, in denen Transgen stabil in die Erbmasse (Genom integriert=transgene Tiere

Neues Gen wird weitervererbt nach mendelschen Regeln.

Mittlerweile ist sind transgene Tiere in der Lage, das neue integrierte Gen in ein fremdes Protein zu übersetzen.

Die jetzige Technik erlaubt vor allem Einschleusen zusätzlicher DNA ins Genom und selten Ersetzen vorhandener Gene (Gentherapie)

-Befruchtete Eizelle Spendermaus werden ausgespült

-DNA-Transfektion: Transgen in die Eizelle

-in pseudogravide Empfängermäuse überführt zum austragen

1.Direkte  Mikroinjektion von mehreren Kopien der fremden DNA in männliche Vorkern

2.Infektion von frühen Teilungsstadien mit rekombinierten Retroviren

• 3.Aggregation von transgenen, totipotent Zellen mit frühen Teilungsstadien oder Infektion in die Blastozyste
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• Transgene werden gereinigt und vielfach kopiert.
• befruchtete Eizellen müssen vor Verschmelzung des w und m Vorkerns (Pronukleus) zur Zygote chirurgisch aus Eileiter genommenàZeitpunkt und Zeitspanne Eingriffs limitiert
• Unter Mikroskop (320-400-fache Vergrösserung) saugt man die Eizellen mit einer Pipette an und injiziert mit einer Kanüle das Transgen (in vielfachen Kopien) in den männlichen Vorkern (ist nesser sichtbar als der weibliche). Mikromanipulatoren zur Übersetzung der Bewegung der menschlichen Hand eingesetzt.
• Integration Transgen in mehrfach hintereinandergeschaltete Kopien an zufällige Stelle de Genoms. Integrationsmechanismus ist unbekannt. Einbau in alle Autosomen und geschlechtlichen Chromosomen. Stabile Vererbung Transgen über mehrere Mäusegenerationen nachgewiesen.
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70um

Genetische Material von Retroviren ist RNA.

1.Transgen in apathogenen Retrovirusstamm einschleusen->Infiziert Embryo in Achtzellstadium

2.RNA wir in reverse Transkriptase in DNA rücküberschrieben und in Wirtsgenom eingebaut. Virus baut sich samt Transgen in alle Embryonalzellen ein

3.

-Das Verfahren ist einfach

-Es lassen sich viele Zellen gleichzeitig infizieren

-Es werden Einzelkopien dieser DNA ins Wirtsgenom eingebaut

4.

-Die Konstruktion der Virusrekombinante ist aufwendig

-Die Länge des einzubauenden Transgens ist limitiert

-Die Vererbung des Transgens kann ausbleiben, wenn die künftigen Keimzellen von der Infektion ausgespart werden

-Die Retrovirus-DNA kann sich als Fremdling auf die Lebensfähigkeit der Embryonen nachteilig auswirken

-Es besteht potentiell die Gefahr einer Verschleppung des Retrovirus

1.Embryonen im Achtzellstadium von unterschiedlichen Mäusen sind in der Lage zu fusionieren. Es entsteht eine Blastozyste. Die Blastozyste pflanzt man in eine maus und es entwickeln sich Mosaiktiere = Chimären, deren Zellen sich aus den beiden unterschiedlichen Embryonen herleiten.

Die Embryonen im Achtzellstadium können sich auch mit undifferenzierten Zellen =Stammzellen verschmelzen-> Diese Fähigkeit früher embryonaler Zellen zu fusionieren und normale Embryos zu bilden macht man sich auch für die Generierung transgener Tiere zu Nutzen.

2.Totipotente Stammzellen können mit einem Transgen transfektiert werden. -> Transgem integriert sich in das Genom nach Einführung in den Zellkern. (genaue molekulare Mechanismus für Integration ist unbekannt). Ereignis kann durhch Marker neo’ selektioniert werden.

3.zwei weiter Vorgehensweisen

- transfektierten Stammzellen werden mit einem Embryo im Achtzellstadium aggregiert

-Transfektierte Stammzellen werden in die Blastozyste von Empfängerembryonen injiziert.

Beide Vorgehensweisen erzeugen ein chimäres Tier.

Um ein transgenes Tier zu erhalten, werden die erhaltenen Chimärtiere mit wildttyp Tieren (+/+) gekreuzt. Daraus entstehen entweder heterozygote oder wildtyp Tiere. Die heterozygoten Tiere können wiederum unter sich gekreuzt werden, um homozygote transgene Tiere zu erhalten.

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Differenzierte Zellen können nicht spontan in andere Zelltypen mutieren, aber verschiedene Gewebe enthalt sogenannte Stammzellen, die noch die Fähigkeit besitzen, in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren.

Totipotent: embryonale Stammzellen, die nur im frühen Embryo.Stadien vorkommen und sich in jeden Zelltyp bilden können

Multipotent: adulte Stammzellen in verschwidenen Gewebe des ausgewachsenen Organismus (z. B. im Knochenmark, in der Haut, im Fettgewebe, in der Nabelschnur und im Nabelschnurblut, im Menstruationsblut, im Gehirn, der Leber oder in der Bauchspeichel-drüse)->können nur beschränke Anzahl von Zelltypen bilden

-In der Grundlagen- und angewandten Forschung zum Studium wichtiger medizinischbiologischer Probleme

-In der Tierzucht zur Entwicklung ertragreicherer und krankheitsresistenterer Nutztiere

-In der pharmazeutischen Industrie zur Produktion biologisch aktiver Proteine in Milch und Ei

-In der Gentherapie

Bei der Integration von Transgenen in ein Genom sind Integrationsort, Ausmass, Zeitpunkt und Gwb-spezifität nicht im Detail bekannt->erschwert Prognose über biologische Wirkung

Beeinträchtigung der Integrität des Empfängergenoms kann Informationen über WW im Chromosomen liefern.

Transgene Tiere ermöglichen Erforschungen physiologischer und pathologischer Vorgänge, wie Tumoren, Genregulation, Embryonalentwicklung

Metallothionein-Wachstumshormon-Fusionsgen

Man setzte den Promotor für Metallothionein vor die Strukturgen für Wachstumshormone.

Metallothionein ist ein schwermetallbindendes Protein der Leber/Milz/Darm und wird bei Kontakt mit Cadmium, Zinkt oder Kupfer induziert ->Schutz toxischer Schwermetalle. Diese Promotoren arbeiten sehr effizient und es reichen schon kleine Menschen (Cadmium 4mM) für eine stark (50-fach) gesteigerte Metallothioneinsynthese.

Kann nun mit dem Metallothionein-Wachstums-Fusionsgen das Wachstumshormon mittels Cadmium ankurbeln





Verabreichung von Cadmium stieg der Wachstumshormon-Blutspiegel bei sechs der sieben Tiere deutlich an. Dies führte zu durchschnittlich 50% grösserem Wachstum als bei den Kontrolltieren. Obwohl der Hormonspiegel bereits bei 13 Tage alten Föten erhöht war, begannen die Tiere erst drei Wochen nach der Geburt übermässig zu wachsen und erreichten ihr Höchstgewicht in der 12. Lebenswoche. Warum? Hormone können nur wirken, wenn sie Rezeptoren haben. Was man hier sieht, das ist entwicklungsabhängig, dass Rezeptoren nur in einem gewissen Programm oder Zeitpunkt der Entwicklung vorhanden sind. Und zu diesem Zeitpunkt muss das Wachstumshormon wirken oder kann es wirken, weil die Zelle einen Rezeptur entsprechend exprimiert. Wenn die Maus über zwölf Wochen ist, werden die Rezeptoren nicht mehr so stark exprimiert, da nützt es nichts mehr, Wachstumshormon zu spritzen, exogen oder als transgenes Tier. Es gibt Sachen, die entsprechend wirken, wenn ein entsprechender Rezeptor an einem entsprechenden Organ vorhanden ist. Nur dann kann es auf ein Hormon reagieren.

• die Fruchtbarkeit der „dwarf little mouse“ ist bei Weibchen normal und bei Männchen reduziert; bei Trägern des Fusionsgens war diese Relation merkwürdigerweise umgekehrt.
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Nicht in der Hypophyse (Ort der physiologischen Wachstumshormonsynthese)

In Leber, Niere und im Darm, wo Metallothionein gebildet wird

Kann man nun durch Wahl des geeigneten Promotor den Expressionsort steuern?

Anstelle Metallothionein-Promotor einen Elastase-Promotor

Elastase ist ein Proteolytisches Enzym, das in azinären Pankreaszellen exprimiert wird

Elastasepromotor-Wachstumshormon-Fusionsgen: Es wurden Wachstumshormone gebildet, aber keine erhöhtes Wachstum->das Wachstumshormon gelant via via Ductus pancreaticus in Darmtrakt   und wird proteolytisch abgebaut

Mausmutant, die inen genetischen Defekt im Lokus des Wachstumshormons aufweist.

Einführung des Fusionsgens korrigieren lässt; die transgenen Zwergmäuse wurden ca. dreimal grösser als ihre nicht transgenen Geschwister.

die Fruchtbarkeit der „dwarf little mouse“ ist bei Weibchen normal und bei Männchen reduziert; bei Trägern des Fusionsgens war diese Relation merkwürdigerweise umgekehrt.

Es wurde kaum eine Wachstumssteigerung festgestellt->man nimmt an das Schwine durch Züchtung bereits Wachstumslimite erreicht haben.

«Es ist etwas möglich, dass in der Natur auch möglich ist!»

Mit gezielter Züchtung Leistung verbesserb->quantitative Leistungssteigerung kann Kontraproduktiv sein

Qualitative Verbesserung: zB Resistenzerhähung, Anpassungsfähigkeit und Veredelung tierischer Produkte (Wollqalität als Beispiel)

Tierschutz darf dabei nicht vernachlässigt werden->eine höhere Leistung darf nicht zu einer schlechteren Gesundheit führen. Erzeugung transgener Tiere darf keine Verarmung natürlichem Genreservoirs bewirken.

½ Liter Milch deckt den Tagesbedarf von den meisten essentiellen Aminosäuren.

Milch nicht für alle gleich erträglich: Laktose-Malabsorption, die auf eine stark reduzierte oder gar fehlende Aktivität der Beta-Galaktosidase im Darm zurückzuführen ist, führt zu profuser Diarrhoe. Besonders Menschen in Länder dritten Welt leiden darunter->Milchpulver ohne Laktose (Disaccharid) und durch Monosaccharide ersetzt (zB glukose)

Biotechnologische Laktosegehalt senken:

-Expression Beta-Galaktosidase im Euter erhöhen und Abbau Laktose fördern

-Translation Proteine, die an Synthese Milchzuckers beteiligt sind, unterbinden: zB alpha-Laktalbumin ist eine Untereinheit der Laktose-Synthetase-> Durch das Einschleusen einer „antisense-Kopie“ dieses a-Laktalbumin-Gens in ein transgenes Tier, würde während der Laktation eine „antisense-mRNA“ synthetisiert. Dies würde die gleichzeitig synthetisierte komplementäre „sense-mRNA“ des natürlich vorkommenden a-Laktalbumin-Gens durch Basenpaarung inaktivieren und deren Translation wie gewünscht verhindern.

Keinen: Laktose ist ein Zucker und hat keinen Promotor, sondern das Enzym, das Laktose produziert, also die Laktosesyntase  muss man nehmen, wenn sie das produzieren möchten Laktose ist ein Zucker.

Deren Milch lässt sich schneller zu Käse umwandeln

Biotechnologen haben Erbgut Kuh so verändert, dass ihre Milch einen hoher Anteil Kasein (Eiweissstoff) enthält. Milch haben zusätzlich grössere Hitzestabilität.

Das Team reicherte Kuhzellen im Labor mit den zusätzlichen Genen an und setzte diese transgenetisch modifizierten Zellen dann in einem ähnlichen Verfahren, aus dem auch das Klonschaf Dolly hervorging, in eine entkernte Eizelle einer Kuh ein (siehe Kapitel 11). Die daraus resultierenden Embryos wurden Kühen eingepflanzt und brachten elf Kälber hervor. Bei Erreichen der Geschlechtsreife produzierten neun der elf Tiere eine Milch, die zwischen acht und 20 Prozent mehr Beta-Kasein und das Zweifache an KappaKasein enthielt. Nach Angaben von Laible und Kollegen hat diese Milch mehrere Vorteile für die Käsegewinnung, unter anderem eine verkürzte Gerinnungszeit.

Gene Pharming: Gewinnung von pharmazeutisch aktiven Proteinen, die durch Tiere (z.B. in der Milch) hergestellt werden.

Will nicht nur pharmazeutische Proteine herzustellen.

Gewinnung medizinisch wichtiger Proteine aus der Milch:



Vorteil: hochreine Proteine in grossen Mengen billig hergestellen

Anwendungsbeispiele:

-Ein Antithrombin (ATryn) in Ziegen hergestellt und für die Anwendung in Patienten mit vererbter Antithrombin-Defizienz zugelassen. Etwa 50 Ziegen könnten schätzungsweise den Antithrombin-Bedarf in Europa decken.

-Proteohormone, Enzyme, „Subunit-Vakzinen“ und andere, mit konventionellen Methoden nicht in grossen Mengen herstellbare Medikamente.

-Gelänge dank dem „Gene Pharming“ auch die Produktion mono- und polyklonaler Antikörper für Diagnostik und Therapie, könnte man sich den Einsatz vieler Labortiere ersparen. Transgen hergestellte Medikamenten sind weit weniger umweltbelastend und wesentlich energiesparender als die herkömmliche Produktion.

In 20 Jahren, seit Schaffung der ersten transgenen Mäuse: Unzählige Forschungsvorhaben mit der Expression therapeutisch relevanter Proteine mit Hilfe genetisch modifizierter Tiere beschäftigt: zu den Proteinen zählen die Gerinnungsfaktoren VIII und IX, Interleukin-2, Fibrinogen, der Plasminogen- Aktivator tPA und Protein C. -> die meisten scheiterten, aber einige Produkte bei transgenen Nutztierzucht auf Pharmaseite haben reele Martkcahncen. Forschern im transgenen Agrobereich dagegen warten ständig mit neuen Produktideen auf, wie etwa bessere Milch für Ferkel, innerlich resistente Rinder, Spinnseide produzierende Ziegen, weniger stinkende oder immerhin phosphatarm urinierende Schweine.

Zahl der Unternehmen, die rekombinante, in der Milch oder im Blut transgener Säugetiere produzierte Humanproteine in der klinischen Entwicklung haben, lassen sich an einer Hand abzählen.

-Gewisse „fremde“ Proteine lassen sich in Escherichia coli nur schwer herstellen, da sie im Bakterium oft nicht korrekt modifiziert werden und deshalb biologisch inaktiv bleiben. Ausserdem sind gewisse bakterielle Nebenprodukte für den Menschen toxisch, was die Aufbereitung und Reinigung der Fremdproteine erschwert. Die Milchdrüse des Säugetieres besitzt die erforderlichen Enzymsysteme in einer physiologischen Umgebung.

-Die Gene der wichtigsten Milchproteine (Kasein, a-Laktalbumin und b-Laktoglobulin) werden effizient exprimiert, weil sie alle einen starken Promotor besitzen. Es ist deshalb zu erwarten, dass ein Fusionsgen bestehend aus einem Milchprotein-Promotor und einem Strukturgen, für ein medizinisch interessantes Protein von der Milchdrüse mit hoher Syntheserate produziert wird.

-Proteine sind aus der Milch leicht isolierbar.

Spinnen lassen sich nicht domestizieren. (man könnte sonst einfach deren Fäden nutzen)

Goldseidenspinne: ihre Netze aus dem stärksten Material der Welt. Enorme Stabilität, hoch fest, elastisch und leicht (neue Material soll nicht nur besser schützen, es soll auch leichter und komfortabler sein als die herkömmlichen Modelle.)

-Forscher haben den genetischen Code des Fadens der Goldseidenspinne geknackt.

- Erbgut des Spinnfadens in Ziegen einbauen. Diese produzieren nun das Spinnfadeneiweiss zusammen mit ihrer Milch, in einem Liter finden sich etwa 20 Gramm.

Problem: Ganz ausgereift ist das Produkt allerdings noch nicht und es muss noch erforscht werden, wie Spinnenseide mit vergleichbarer Stabilität hergestellt werden kann. Nehmen die Fasern Wasser auf, schrumpfen sie auf die Hälfte ihrer ursprünglichen Länge. Kritiker sind ausserdem der Ansicht, die hohe Elastizität der Faser beruhe weniger auf ihrer chemischen als vielmehr auf ihrer räumlichen, spiralförmigen Struktur. Die aber werde dem Faden durch die nur schwer zu kopierenden Spinndrüsen verliehen.

Kapitel 12

Einschleusen fremder DNA in Erbgut Empfängerorganismen für Bakterien, Hefen und Säugetiere möglich.

Transgene Tiere sind Tiere, die Fremdgen (Transgen) stabil in Genom eingebaut haben. Diese Transgen wird vererbt.

Expression der Fremdgene ist wünschenswert-> also Synthese der entsprechenden Proteine im Empfängertier.

Erhofft Fortschritte in:

- der Grundlagenforschung (zum Beispiel Kenntnisse über das An- und Abschalten von Genen)

-qualitative Leistungsverbesserung der landwirtschaftlichen Nutztiere (zum Beispiel Resistenzerhöhung)

-die Erzeugung therapeutisch wichtiger Proteine in Milch und Ei (zum Beispiel Proteohormone und Gerinnungsfaktoren).

Die hauptsächlich verwendeten Methoden zur Erzeugung von transgenen Tieren sind:

1.Die Mikroinjektion des Transgens in die befruchtete Eizelle

2.Die Verschmelzung von transgenen, totipotenten Zellen in einem Empfängerembryo zu einer Chimäre

3.Die Infektion früher Embryonalstadien mit rekombinanten Retroviren, die sich stabil in das Genom des Embryos einbauen.

Probleme für die zahlenmässig und inhaltlich bescheidenen Erfolge mit der Produktion menschlicher Proteine durch transgene Nutztiere:

weniger die Folge der komplizierten Aufarbeitung der Proteine oder die schwieriger durchzuführende klinische Prüfung.



->Vielmehr liegt die Ursache bei den zahlreichen technologischen Prblemen, die sich der Generierung der letztendlich notwendigen transgenen Viehherden zu suchen. Kosten, der Embryonenverbrauch und die Fehlschläge bis zur Lebendgeburt auch nur eines einzigen Gründertieres sind enorm - und übersteigen in vielen Fällen die proklamierten Einsparungen im Vergleich zur grosstechnischen Zellkulturtechnik.

Die für die Herstellung einer transgenen Gründerkuh veranschlagten Kosten liegen zwischen 300’000 und 500’000 USD, die Produktion eines einzelnen transgenen Schweins kostet etwa 100’000 USD, eines Schafes oder einer Ziege rund 70’000 USD. Eine Effizienzanalyse aus dem Jahr 1994 kam zum Ergebnis, dass eine einzige transgene Ziege bei einem Expressionslevel von 3 mg/ml menschlichen Plasminogen-Aktivators der Tagesleistung eines 1000-Liter- Reaktors mit Mauszellen entspricht. Für das rekombinante Antithrombin III liegt der Expressionslevel in der Ziegenmilch sogar bei durschschnittlich 14 mg/ml. Um den weltweiten Bedarf an Antithrombin zu decken - so haben Forscher unter Berücksichtigung der täglichen Milchproduktion und der unterschiedlich guten Expression des Transgens bei den einzelnen Nutztierarten errechnet - sollten eigentlich 3 transgene Kühe, 6 Schafe, 12 Ziegen, 81 Schweine ausreichend sein. Würde das Protein jedoch in transgenen Kaninchen produziert, so wären 15’000 Exemplare erforderlich!