DNA Diagnostik

Lange beschränkte Möglichkeiten, Säugetiere zu identifizieren->Fingerabdrücke, Blutgruppen, Proteinpolymorphismen und weitere aufwendige Methoden, Ohrenmarker bei Tieren. Informationen Phänotypen sind im Genotyp auf DNA.

Will direkt DNA analysieren für Identifikationen, Erbkrankheiten, Verwandtschaftsabstammungen. ->kann Gene direkt in dann untersuchen und Chromosomen lokalisieren

Klassische Methode Gene zu kartieren und auf Genom zu lokalisieren: Häufigkeit spezifischer Eigenschaften gemeinsam vererbt werden korreliert mit Distanz zwischen Genen auf Chromosomen->nahe Gene meist gemeinsam vererbt (werden bei Meiose weniger durch Rekombinationsereignisse getrennt)

Kann mit molekularen Marker das Genom markeiren.

Kopplungsanalyse hat an Bedeutung verloren->direkte Sequenzoeren grosser DNA Abschnitte ist mittlerweile sehr einfach

Gehalt Genom im Säugetier grösser als für Kodierung sämtlicher Proteine nötig. (schätzt 1-2% werden zu Proteine übersetzt->Rest vor allem aus mitte- bis hochrepetierten DNA-Sequenzen)

Genom hat auch natürlicherweise variable (polymorphe) DNA-Abschnitte->ca. alle 500 Basenpaare zwischen homologen Chromosomen Sequenzunterschiede, die durch Mutationsereignisse (Mikrodeletionen und Mikroinsertionen) entstanden sind. So ergeben sich bei 109 Basenpaare 2*206 Unterschiede und dennoch sind zwei Genome zu 99.8% identisch

-Satelliten-DNA -Zentromer- und Telomer-Regionen der Chromosomen lokalisiert ist -Maxi-,Midi-,Mini-,Mikro-Satelliten-DNA (je nach länge Repeat-Units, verstreut auf Genom)->Basensequenz vielfach Wiederholt aufgereiht =Repeat-Unit, und tandemartige Anordnung auf Genom= Tandem-Repeats

Polymorphismus und repetitiven Elemente eines Genoms können für Genotypisierung eines Individuums genutzt werden. Analyse der Sequenzunterschiede und der Repeats durch den Verdau der DNA kann mittels Restriktionsenzymen (Endonukleasen) und nachfolgenden Southernblots oder PCR besprochen werden.

Mutationsereignisse= Basenaustausche kann mit DNA-Restriktionsanalyse nachgewiesen werden und wird als genetische Marker für Genkartierung von Chromosomen eingesetzt.

Erkennung Basenaustausch mittels Restriktionsenzym möglich, dessen Erkennungssequenz vom Basenaustausch betroffen ist->Durch Basenaustausch kann Schnittstelle Restriktionsenzyme verloren gehen oder es kann eine zusätzliche Schnittstelle entstehen: Beides kann man anhand DNA-Fragmentlänge nach Verdau Restriktionsenzyme erkannt werden = RFLP

Mit RFLPs kann man auch Kopplung an Krankheitsgene nachweisen was zu prä- und postnatalen Diagnose verwendet wird

Es gibt DNA-Abschnitte, die sich sehr polymorph verhalten und ähnlich wie RFLP kann deren Variabilität an veränderten Längen von DNA-Fragmenten erkannt werden.

Grund Längenpolymorphismus: nicht wegen Fehlen oder hinzukommen von Schnittstellen für Rekombinationsenzym->sondern unterschiedliche Anzahl Wiederholungen einer bestimmten DNA Sequenz = Minisatelliten oder VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats)



Minisatelliten in menschlichen Myoglobinen der über ganzes Genom (man nimmt alle autosomalen Chromosomen, also ohne Geschlechtschromosomen) verteilt. Hohe Variabilität diese DNA-Sequenz scheinen Mutationsmechanismen zu sein, die die Struktur DNA stark verändern.

Mutationsmechanismen:


1.Transpositionen

2.Ungleiche Crossing-over

3.Replikation-Slippage

Physiologische Bedeutung Minisatelliten deutet auf direkte oder indirekte Beteiligung dieser Sequenzen an DNA-Rekombinationsereignissen hin.

Minisatellit gehört zu ganzen Familie von VNTR-Sequenzen, die über Genom verteilt sind und alle dieselbe Core-Sequenz in Repeat-Units enthalten.

Bei allen Genorten mit solchen Minisatelliten ist hohe Variabilität=Längenpolymorphismus vorhanden.

DNA-Sonde: genomische DNA kann untersuch werden, zB Minisatellit des genannten Myoglobingens kann sämtliche Genorten mit Minisatelliten gleichzeitig untersuchen->DNA-Fingerprinting-Methode

1.Schritt-Isolation: von untersuchenden Individuum müssen genügend hochmolekulare DNA aus kernhaltigen Zellen isoliert werden: kann Leukozyten des Blutes (einfache Methode) oder kernhaltige Zellen anderer Gewebe (aufwendige Methode) genutzt werden

Bei Gewebe muss man berücksichtigen und austesten: unterschiedliche Methylierungszustände der DNA (Methylierung des C5 des Cytosines) in verschiedenen Geweben.

• Hochmolekulare DNA ist auf Scherkräfte anfällig und es bedarf vorsichtiger Behandlung um Strangbrüche zu minimieren.
• Schritt-Schneiden: DNA wird von Restriktionsenzym (Teirartspezifisch) in grosse Anzahl Fragmente unterschiedlicher Länge geschnitten.

-Es können alle Restriktionsenzyme genutzt werden , solange im Bereich «Tandem-Repeats» keine Basensequenz vorkommt, die Erkennungssequenz des verwendeten restiktionsenzyms entsprichtàBevorzugte Restriktionsenzyme: Erkennungssequenz von 4 Basenpaare (schneidet häufiger als zB Erkennungssequenz von 6 Basenpaare): will damit viele DNA-Fragmente erhalten die nur aus Tandem Repeats aufebaut sind unf ast keine zusätzlcihe DNA enthalten

- Verschieden langen DNA-Fragment enthalten nicht alle notwendigerweise Minisatelliten-DNA

1.Schritt: DNA-Fragmente müssen mittels Agarosegelelektrophorese entsprechend ihrer länge aufgetrennt werden-> man erhält ein DNA-Fragmentmuster im Gel

2.Schritt:

- Vor Transfer werden doppelsträngigen DNA- Fragmente durch alkalibehandlung denatuiert->Einzelsträngig, sodass sie später bei Hybridiastion verwendete einzelsträngige DNA- Sonde an die einzelsträngige DNA-Sonde an die einzelsträngige DNA hybridiesieren kann

- DNA-Fragment wird entweder elekrtophoretisch unter Vakuum oder mittels Saugkräften auf Nylonmembran transferiert =Southern-Blotting

3.Schritt: Schritt: Nach dem Transfer auf die Nylonmembran -> einzelsträngigen DNA-Fragmente optimal an Membran festgeklebt durch eine Hitzebehandlung oder eine UV-Bestrahlung.

4.Schritt: Membran ist bereit, um mit der radioaktiv markierten Minisatellitensonde inkubiert zu werden.

Erkennung DNA-Fragmente verbessern:, herstellen radioaktiver Sonde mittels molekularbiologischer Methoden-> radioaktive Sonden besteht beispielsweise aus der Core-Sequenz des Jeffreys Minisatelliten. =>genetische Fingerabdrücke eines Individuums entsteht

wie Temperatur, Salzstärke und Zeitdauer der Inkubation

• Durch Waschschritte: Sondenmoleküle, welche nicht oder nur unspezifisch gebunden haben, von der Nylonmembran entfernt. ->Auf der Nylonmembran bleiben nur diejenigen Sondenmoleküle, die aufgrund der komplementären Basenpaarung an die Core-Sequenz der Minisatelliten-DNA gebunden haben.
• 

Die Nylonmembran wird auf einen Röntgenfilm aufgelegt:

-um die DNA-Fragmente, welche Minisatelliten-DNA enthalten, als Schwärzungen auf dem Film sichtbar zu machen. -> Muster von schwarzen Banden auf dem Film, das einem Strichcode ähnlich ist. Jedes Individuum sowie jeder Inzuchtstamm (zum Beispiel Mäuse) haben ihr spezielles Bandenmuster.

Die radioaktive Sonde kann von der Membran entfernt und letztere zur neuerlichen Hybridisierung mit einer anderen Sonde verwendet werden.

1.Ein Individuum (Mensch oder Tier) kann anhand seines Fingerprinting-Musters eindeutig erkannt und identifiziert werden. Ausnahmen sind eineiige Zwillinge, die ein identisches Fingerprinting-Muster aufweisen.

2.Je näher 2 Individuen verwandt sind, desto mehr gemeinsame Banden weisen ihre Fingerprinting-Muster auf.

3.Die längeren DNA-Fragmente (4’000 - 20’000 Basenpaare) sind vor allem individuenspezifisch, während die kürzeren (4’000 Basenpaare) eher artspezifisch zu sein scheinen.

4.Diese Banden werden nach den Mendel‘schen Regeln von den Eltern auf ihre Nachkommen vererbt, das heisst die eine Hälfte der Banden im Fingerprinting-Muster eines Kindes stammt vom Vater und die andere von der Mutter. 5

5.Die Banden zeigen ein kodominantes Verhalten, das heisst Heterozygotie (2 Banden) oder Homozygotie (1 Bande) können an einem Genort festgestellt werden.

hochvariablen Minisatelliten-Sequenzen zuerst im menschlichen Genom gefunden. -> Jedes Individuum kann durch gleichzeitige Erfassung dieser polymorphen DNA-Abschnitte anhand des genetischen Fingerprintingmuster, eindeutig indentifiziert werden

Erste Anwendungsmöglichkeiten: Forensik ->Anhand kleinsten Spuren (Haarbälge, Hautfetzen, Bluttropfen etc.) Täter von Gewaltverbrechen zu überführen.

Weitere Anwendungsmöglichkeiten in Humanund Veterinärmedizin: hochvariablen DNA-Abschnitte auch bei Tieren und Pflanzen vorhanden. Artspezifische Sonden ermöglichen die Anwendung bei allen Tierarten.

Hunderassen haben öfters einen hohen Inzuchtgrad und dadurch eine stark erhöhte Prädisposition zu medizinischen Problemen->300 Erkrankungen mit evtl. genetischen Ursachen bekannt.

Berner Sennenhund: haben häufiger Nierenprobleme und eine eindeutige Häufung der Glomerulonephritis -> erbliche Disposition sehr wahrscheinlich

Ziel ist es die Träger dieses Gendefekts auszuschliessen. Dazu braucht es geeignete Diagnosemöglichkeiten, da der Phänotyp zu spät kommt.

Möglichkeit: Molekulargenetische Analysemethoden->Diagnose der Veränderung im Genom vor der Entwicklung von Krankheitssymptomen und Weitervererbungen unterbinden.

Zwei Analysemethoden bei Berner Sennenhunde (z.T. auch Neufundländer): -Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)-Technik: zur Suche der Veränderung im Genom und zur Diagnose angewendet. Vorraussetzung-->die Ursache der genetischen Erkrankungen in einer anderen Tierart oder beim Menschen bereits bekannt. -Das DNA-Fingerprinting bietet gute Möglichkeit, Züchter bei der Zuchtauswahl zu unterstützen. ->Anhand genetischen Muster können Paarungen zusammengestellt werden, die die genetische Variabilität innerhalb der Hunderasse erhöhen. Ebenso können damit Vaterschaftsuntersuchungen und Identitätsnachweise durchgeführt werden.

-neuere Generation von genetischen Markern mit besseren Vorraussetzungen->Mikrosatelliten.

-treten häufiger und regelmässiger als Minisatelliten auf und kommen in allen eukaryontischen Genomen von Hefe bis Mensch vor.

-Mikrosatelliten wurden bei Menschen, Maus, Schwein, Rind und Hund isoliert und als Marker getestet.

-Sind polymorph und mittels PCR einfacher darzustellen-> ideale Marker zum Aufbau einer hochauflösenden genetischen Karte.

-Repeats der Mikrosatelliten sind aus zwei, drei oder vier Basenpaaren aufgebaut, die sich 10 - 50 mal hintereinander wiederholen können.

-am meisten verwendeten Mikrosatelliten sind (CA)n-Repeats, die gleichmässig im menschlichen Genom auftreten und im Abstand von 30 kb zu finden->Dadurch können sich einzelne Allele durch zwei bis ein vielfaches von zwei Basenpaare unterscheiden->grosse Allelvielfallt

-zeigen sich innerhalb einer Familie relativ stabil, variieren dagegen innerhalb einer Population stark.

-Folgen Mendelschen Gesetz der Neukombination der Gene.

Spezifische Primer herstellen: muss flankierenden Regionen ausserhalb der Mikrosatelliten kennen, so können Mikrosatelliten durch PCR amplifiziert werden.

PCR wird auch für die Analyse von Minisatelliten (als Alternative zum DNA Fingerprinting) durchgeführt: Unterscheiden von Mini- oder Mikrosatellitenallele aufgrund variablen Anzahl ihrer Repeats durch Längenauftrennung der PCR-Produkte mit Hilfe eines Gels

Vorteil PCR: Fragmentlänge durch die Wahl der Primer entspricht exakt der Länge der Repeats.

Beim DNA Fingerprinting: will keine zusätzlichen Sequenzen mitanalysieren, die Fragmentgrössen sind aber durch das natürliche Vorkommen der Restriktionserkennungssequenzen bereits vorgegeben.

Für detektieren eines DNA-Unterschied von 2 Basenpaaren durch Auftrennung der Fragmenten mittels eines Gels, müssen die Fragmente so klein wie möglich

Die durchgeführten Mikrosatelliten-Untersuchungen beim Berner Sennenhund (und z.T. Neufundländer) zeigten, wie schnell sich genetische Veränderungen beim Hund manifestieren.

Dies vermag auf der DNA-Ebene die enorme Vielfalt der Morphologie der heutigen Hunderassen zu erklären.

PCR Vorteile: Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Sensitivität ->nicht nur in den molekularbiologischen- und biochemischen Labors, sondern auch in den Diagnostiklabors der Human- und Veterinärmedizin. (evt wird PCR noch so weit

vereinfacht, dass Praktiker eine Diagnose stellen können.

Durch gentechnologische Methoden->genetische Variabilität direkt auf der DNA-Ebene zu untersuchen.

Entdeckung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) und hochvariabler Regionen (HVR) auf der DNA haben die Entwicklung von neuen genetischen Markern ermöglicht, welche zur Lokalisation von normalen und von Krankheitsgenen auf den Chromosomen eingesetzt werden können.

Bei Minisatelliten sind diese Polymorphismen so hochvariabel, dass sie als DNA-Fingerabdruck (DNA-Fingerprinting) zur eindeutigen Identifikation eines Menschen oder Tieres herangezogen werden können.

Die neuere Generation von Mikrosatelliten haben den Vorteil, dass sich einzelne Allele durch die Dinukleotidhäufung unterscheiden, was zusammen mit der PCR zum eindeutigen Allelnachweis herangezogen werden kann. Dies ermöglicht ganz neue Ansätze im Erkennen von genetischen Krankheiten bei Tieren.