New Technologies

Definieren der Begriffe: Genom und Genomics, Transcriptome und Transcriptomics, Proteome und Proteomics

erkläre der Konzepte: Systembiologie, High-Throughput Technologien, Synthetic Lethality

Zuordnen der Technologien und nennen von Anwendungsmöglichkeiten: DNA / RNA Sequencing, Microarrays, Yeast-2-Hybrid, Massenspektrometrie

• Das Genom: Gesamtheit der Erbinformation in einer Zelle
• Genomics: die wissenschaftliche Disziplin, welche die Struktur und Funktion von Genomen und Genen erforscht
• DNA-Sequenzierung: Bestimmung der DNA-Sequenz (der Nucleotid-Abfolge), kann verschiedene Spezies miteinander vergleichen und anhand der DNA gruppieren

Die heutigen Methoden sind in den früheren immer noch sehr ähnlich

Sanger Sequencing:

• Kann zwischen 800 und 1000 (10^3) Basenpaare sequenzieren -> dadurch können bestimmte Genommutationen schnell erkannt werden, Monogenetische Ursache, Genabschnitt gezielt überprüft

• Next Generation Sequencing:
• Kürzere Sequenzen werden parallel gelesen (100-150 Basen), Computation -> 10-100 Gigabasenpaare (10^10-10^11) pro Tag (High-Throughput)
• Damit werden alle Gene gleichzeitig überprüft, um komplexere Krankheitsursachen zu identifizieren und zur Diagnostik eingesetzt 

• Illumina (Solexa) Sequencing:
• High Throughput
• Die 4 DNA-Basen werden alle mit verschiedene Farben angemalt
• Diese Basen konkurrieren um einen Platz am DNA-Strang, die die nicht binden können, werden weggewaschen
• Ein Laser kann die Färbungen erkennen und man mach ein Foto von den gebundenen Basen
• Der Prozess wird mit einem weiteren Stück DNA gemacht, bis das ganze Genom sequenziert

Adapter werden an bestimmte DNA-Moleküle angeklebt-> kleben an die Glasplatte, mit den DNA-Molekülen mit der gleichen Basensequenz-> Cluster werden gebildet und von Computer entschlüsselt

• ...Genomorganisation: wie die DNA verpackt ist
• ...Expressionskontrolle: wie die DNA-Transkription gesteuert wird
• ...Wachstumsregulation: man kann vergleichen, welche Hox-Gene die unterschiede Organismen gemeinsam haben
• ...Keimesentwicklung : Ausbreitungsketten erkennen (erkennt man wer, wer angesteckt hat, indem die Mutationen des Virus vergleicht)
• ... Evolution: Erlaubt es den Stammbaum der Evolution genauer zu rekonstruieren, oder komplexe Merkmale besser zu untersuchen

• Ziel: Vollständige Entschlüsselung der Humanen Genoms
• Über 1'000 Wissenschaftler von über 40 Länder, sehr teuer, von 19990 bis 2003
• Humanes Genom besteht aus 3.4 Mrd. Basen, ca. 20'000-25'000 Gene

• Sequenziert Krebspartien und teilt sie in Gruppen ein, jede Gruppe spricht dabei anders auf Krebstherapien an, weil jeder Krebstyp eine bestimmte Signatur zeigt, diese Signatur kann mit unterschiedlichen Methoden behandelt werden und sprechen auch unterschiedlich darauf an.

• ... Verwandschaftsbeziheungen aufdecken
• ... phänotypische Merkmalen erklären wie
•     Krankheitsursachen bei Mensch und Tier 
•     komplexe Krankheitsbilder die dadurch in Untergruppen unterteilt werden können
•     Gewünschte und unerwünschte Merkmale bei Zuchttiere 
•     Gewünschte und unerwünschte Merkmale bei Pflanzen, insbesondere für die Nahrungsmittelherstellung

• Das Transkriptom: Die Gesamtheit aller mRNA Transkripte in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt.
• Von Umweltbedingungen, Stoffwechsellage, Zellzyklusphase, Krankheit abhängig
• Transkriptomics: Analyse und Quantifizierung aller transkribierten mRNA Molekülen einer Zelle/ eines Gewebe zu einem exakt definierten Zeitpunkt
• Jeder Zelltyp gebraucht eine eigene Auswahl an Genen und setzt sie in Biomoleküle um (Zell exprimiert ein Set von Genen)
• Das Muster der aktiven Gene (Expressionsprofile) ist Zelltypspezifisch und abhängig vom Entwicklungsstatus und den Umweltbedingungen
• Gibt Housekeeping Genes (liegen in allen Zellen des Körpers vor) und Specific Genes, die nur in bestimmten Zellen aktiv sind

• Beantwortet die Frage: Wann werden, welche Gene transkribiert
• Grundlegende Strategie: mRNA aus einer bestimmten Zelle wird isoliert und als Matrize für die Synthese von cDNA-Bibliotheken durch reverse Transkription verwendet und diese cDNA mit anderen DNA-Bibliotheken zu vergleichen
• mRNA wird danach verdaut und der cDNA bleibt übrig
• Automation erlaubt diese einfach und in einem grossen ("high-throughput" = Hochdurchsatz) Massstab durchzuführen
• DNA-Chip (DNA-Mikorarray)-> einer grossen Anzahl einzelsträngiger DNA-Fragmente, welche unterschiedliche Gene repräsentieren, auf einem gläsernen Träger an dicht aufgetragen -> weiss genau, welches Gensequenz wo auf dieser Glasscheibe ist, kann die cDNAs auf die Platte bringen, diese binden an die vorgegebenen Genen, können nur an der komplementären Sequenz binden
• Je nachdem wie viele Gene an den einzelnen Punkten gebunden werden, gibt es eine andere Farbe
• Dieser Verfahren erlaubt es die Expression der Gene aus unterschiedlichen Proben zu analysieren und co-regulationen herausfinden

Die Frage: welche Gene in verschiedenen Situationen transkribiert werden

• Grundlegende Strategie: das Isolieren von mRNA aus bestimmten Zellen als Substrat für Next Generation Sequencing, Anfang ist gleich wie beim Biochip; die Herstellung einer cDNA
• Je höher das Signal, desto mehr wurde das Exon transkribiert

RT-PCR (reverse-transcriptase PCR):

• Basiert auf Sequenz-spezifischen PCR-Primern
• Quantifiziert die Menge einer bestimmten mRNA, also die Menge des Produktes eines Gens

• Microarray und RNA-Sequencing:
• Quantifiziert die Menge aller mRNAs, also die Menge aller Genprodukte gleichzeitig

Proteom: die Gesamtheit aller Proteine in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt; ist abhängig von Umweltbedingungen, Stoffwechsellage, Zellzyklusphase, Krankheit

Proteomics: Ziel; die Analyse und Quantifizierung aller exprimierte Proteine einer Zelle zu einem exakt definierten Zeitpunkt zu identifizieren

• leistungsfähige In-vivo-Methode zur Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen
• wenn X und Y interagieren (aneinander binden), kommt es zur Expression des Reporter Gens
• wenn X und Y nicht interagieren, wird das Reporter Gen nicht exprimiert
• X: Köder (Bait)
• Y: Beute (Prey)
• Alle Interaktionspartner des Köders werden identifiziert, z.B. alle Substrate einer Protease
• High-Throughput: Die Interaktionspartner mehrerer Köder werden in einem Experiment identifiziert, z.B. alle Substrate verschiedener Proteasen

Wird gebraucht um Unterschiede in Proteinmuster detektieren

• Schritt 1:
• Trennung der Proteine durch eine 2D-Gelelektrophorese
• Horizontale Trennung-> Proteingemisch durch einen pH Gradient in Längsrichtung durch ein e-Feld getrennt (Trennung nach Ladung)

Vertikale Trennung-> anionisches SDS (Natriumdodecylsulfat) an Protein angehängt-> Anlegung eines senkrechten e-Feld-> negative SDS-Proteinkomplexe wandern im Gel (Auftrennung nach Proteinmasse)

Anschliessende Färbung der einzelnen Proteine

Schritt 2:

Proteine werden durch Massenspektrometrie identifiziert, indem sie an gewissen Stellen gespalten und analysiert werden. Diese "hinterlassen" ihre eigene Fingerprints (jeder Peak entspricht einer Peptidkette)

Anschliessend werden die Muster mit anderen aus einer Datenbank vergliechen und die Proteine identifiziert

Wenn das Protein nicht identifiziert werden kann, werden die einzelnen Fragmenten analysiert (Mikrosequenzierung)

• versucht über einen interdisziplinären Ansatz mit Methoden und Konzepten aus der Molekularbiologie, den Systemwissenschaften und der Informatik zu einem verbesserten Verständnis der in einer Zelle ablaufenden Prozesse zu gelangen

Super-Resolution Microscopy

• Quantitative Image-Based Cytometry
• Hauptvorteile:
• Unabhängige Quantifizierung der Zellantwort auf genotoxische Stressfaktoren
• Direkte Korrelation von unterschiedliche DNA-Schädigung und Reparaturmarker
• Kombiniert die Analyse der einzelnen Zelle mit der Populationdynamik
• Entflechtet subpopulationsspezifische Antworten
• Erlaubt die Evaluation der Zell-zu-Zell-Variation