05 PCR

  1. Polymerázová řetězová reakce - definice
    • Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis)
    • Publikace +Nobelova cena
    • = Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace.
    • - K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě.
    • - PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování.

    • -PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA:
    • ...Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec.
    • ...K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován.
    • ...Jako templáty pro syntézu mohou sloužit  oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci.
    • - Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek.
    • - Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií).

    • Předpoklady pro zavedení PCR
    • Syntéza oligonukleotidů
    • Vlastní myšlenka (K. Mullis)
    • Teplotně stabilní DNA polymeráza
    • Automatické termocyklery
  2. Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů, ale in vitro ...
    vyžaduje pouze jeden enzym
  3. při Replikaci DNA in vitro potřebujeme:
    • 1. Reakční směs obsahuje:
    • - Templátovou NK (DNA nebo RNA).
    • Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula.
    • ...Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR.
    • ...Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+
    • ...znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR
    • - Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd…

    2. Primery -  Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10 - 30 nukleotidů.

    3. dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí

    4. Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza.

    • 5. Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C.
    • Taq  Thermus aquaticus
    • Tth  Thermus thermophilus
    • Tma  Thermotoga maritima
    • Pfu  Pyrococcus furiosus
    • Pwo  Pyrococcus woesei
  4. charakterizuj REAKČNÍ PODMÍNKY PCR:
Author
iren
ID
347251
Card Set
05 PCR
Description
molekularni biologie,CV,prezentace
Updated