05 PCR

• Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis)
• ^{Publikace +Nobelova cena}
• = Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace.
• - K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě.
• - PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování.

• -PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA:
• ...Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec.
• ...K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován.
• ...Jako templáty pro syntézu mohou sloužit  oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci.
• - Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek.
• - Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií).

• Předpoklady pro zavedení PCR
• Syntéza oligonukleotidů
• Vlastní myšlenka (K. Mullis)
• Teplotně stabilní DNA polymeráza
• Automatické termocyklery

vyžaduje pouze jeden enzym

• 1. Reakční směs obsahuje:
• - Templátovou NK (DNA nebo RNA).
• ^{Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké}: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula.
• ...Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR.
• ...Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+
• ...znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR
• - Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd…

2. Primery -  Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10 - 30 nukleotidů.

3. dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí

4. Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza.

• 5. Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C.
• Taq  Thermus aquaticus
• Tth  Thermus thermophilus
• Tma  Thermotoga maritima
• Pfu  Pyrococcus furiosus
• Pwo  Pyrococcus woesei