04 Hybridizace

• Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul
• Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA.

působením vysoké teploty (90-100^oC), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina)

změna v uspořádání bazí při denaturaci zvyšuje absorbci světla při vlnové délce 260 nm

• Průběh denaturace a renaturace sledovaný na základě absorpce UV-světla
• 

• - obsahu GC (a AT)
• - koncentraci solí
• - délce sekvence
• - přítomnosti nespárovaných úseků

• Teplota tání DNA Tm - se lineárně zvyšuje s obsahem GC
• 

Teplota, při které dochází k denaturaci DNA závisí na obsahu guaninu a cytozinu v DNA. Čím více obsahuje GC-párů, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Rozmezí denaturačních teplot je zhruba 30 - 100^oC. Denaturaci DNA provází hyperchromní efekt, tj. dochází ke zvýšení absorbance ultrafialového světla. Hyperchromní efekt je způsoben rozpadem dvouřetězcových molekul DNA na molekuly jednořetězcové, které absorbují UV-záření silněji než molekuly dvouřetězcové.

Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se symbolem Tm. Tato teplota odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky.

• opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing“) podmínek
• nastává při pomalém ochlazování (65^oC) roztoku teplem denaturované DNA
• nenastává při prudkém ochlazení roztoku DNA s vyšší teplotou než T_m
• při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA
• rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí

Spojení částečně nebo úplně komplementárních DNA řetězců pocházejících z různých dvouřetězcových molekul DNA nebo podobně spojení DNA-řetězce s RNA řetězcem; oba procesy probíhají in vivo a mohou být navozeny in vitro

Renaturované molekuly, v nichž se spojily řetězce pocházející z molekul DNA různých zdrojů

• Homoduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou.
• Heteroduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou

• - test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) – z toho lze vyvozovat stupeň příbuznosti testovaných organismů
• - testy genové exprese (hybridizovat mnohou i molekuly DNA a RNA)
• - lokalizace genů na chromozomech
• - testy paternity, identifikace osob, atd.
• - amplifikace NK pomocí PCR (připojení primeru k templátu je rovněž typ hybridizační reakce)
• - vyhledávání klonů nesoucích rekombinantní DNA
• - čipové technologie („microarrays“)
• - spojování fragmentů při klonování

značená sonda o známé nukleotidové sekvenci

• Southernův přenos - DNA
• northernový přenos - RNA
• westernový přenos - proteiny
• southwesternový přenos - proteiny vázající DNA (sondou je DNA)
• northwesternový přenos - proteiny vázající RNA (sondou je RNA)

• ^{technika vyvinuta E.M. Southernem}
• ^{běžné použití při detekci přítomnosti určitých genů v buněčné DNA nebo při sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů}
• POSTUP:
• 1. rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou
• 2. denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting“ - přesávka)
• 3. inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou - ^{dojde k hybridizaci sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru}
• 4. odmytí nenavázané sondy
• 5. detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie)

• 
• 

• kapilární přenos
• 

• elektroforetický přenos
• vakuový přenos

• 1. sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA
• 2. denaturace
• 3. vzorky DNA naneseny na podložku v podobě teček
• 4. hybridizace se sondou
• 5. hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, beta-spektrometrem)

• - restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA (cDNA)
• - mRNA izolovaná z buněk nebo tkání
• - RNA transkripty in vitrosyntetické oligonukleotidy (připravené podle sekvence aminokyselin)

• 1. pomocí náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling“)
• 2. posunem jednořetězcového zlomu („nick translation“)
• 3. koncové značení
• 4. značení vektoru s naklonovanou sondou
• 5. značení transkriptů in vitro (RNA)

• = Značení DNA pomocí náhodných oligonukleotidů
• k ssDNA se přidá směs hexanukleotidů o různé sekvenci
• k těmto primerům připojuje DNA polymeráza značené nukleotidy

• = Značení DNA posunem jednořetězcového zlomu
• Vytvoření náhodných jednořetězcových zlomů DNázou I
• DNA polymeráza I odstraňuje nukleotidy od místa zlomu (exonukleázová aktivita 5´- 3´)
• Současně ve stejném směru připojuje značené nukleotidy k 3´konci zlomu

• Značení konců DNA fragmentů
• a) značení 5´konců
• b) značení 3´ konců

• Digoxineninem
• 

• Biotinem
• fluorescenčními značkami (fluorescein, rhodamin, kumarin)

• protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou (AP)
• Substrát pro AP:  
• A) X-fosfát + NBT
• B) lumi-fosfát

Enzymová reakce: odstranění fosfátové skupiny

• Detekce: 
• A) po reakci s kyslíkem se produkt reakce zbarvuje
• B) emise světla, zachycení na filmu

1. Prehybridizace - zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu

• 2. Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68oC, 42oC s formamidem)
•   ^{- lze volit různé podmínky hybridizace („stringence“)}

• 3. Promývání - odstranění nenavázané sondy
• ^{(účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí)}

• 4. Detekce navázané sondy
•   - autografie
•   - imunologická reakce: barvení + luminiscence + fluoroscence

• 5. Rehybridizace
•   - odmytí navázané sondy
•   - aplikace další sondy

= Detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách radioaktivními nebo fluorescenčními sondami.

• Využití:
• - prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA)
• - lokalizace genů (sekvencí) na chromozómech (hybridizace jaderné DNA)

• fluorescein (zelená fluorescence)
• rhodamin (červená fluorescence)
• kumarin (modrá fluorescence

• 1. Použití hybridizace in situ pro detekci genů  
• 2. Detekce bakteriálního klonu nesoucího určitý fragment DNA
• 

• 3.  Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA
• 

• 4. Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP)
• 
• ^{Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči}

• 5. Ribotypizace bakterií
• 

• 6. Využití VNTR při přípravě profilu DNA
•