10 Buněčná signalizace a karcinogeneze

• Signalizace je nástrojem komunikace
• ↣buňky vzájemně komunikují a koordinují své aktivity 
• ↣ základem buněčné komunikace je tvorba/detekce signálů, jejich zpracování a zajištění adekvátní odezvy 
• ↣ Zásadně ovlivňuje chování buněk (metabolismus, růst, diferenciaci, pohyb, sekreci proteinů, atd.)
• Princip signalizace
• tvorba signálu
• registrace signálu receptorem
• přenos signálu z receptoru k efektorům („signal transduction“)
• efektorem může být transkripční faktor, enzym, složka cytoskeletu, atd...
• schopnost buňky reagovat na podněty je geneticky určena - spektrem receptorů, které je schopna vytvořit

• 
• SHRNUTÍ
• buňky komunikují prostřednictvím signálních molekul
• signály buňky zachycují signály specifickými receptory na povrchu nebo uvnitř buněk
• rozmanitými nitrobuněčnými signálními drahami se signál o interakci ligandu s receptorem dostává k buněčným efektorům, který zajistí adekvátní reakci buňky
• schopnost produkovat a/nebo detekovat signály a adekvátně na ně reagovat je podmínkou řádného vývoje embrya i udržování homeostáze dospělého organismu v proměnlivém prostředí

• specializované produkční buňky seskupeny do žláz
• signální molekuly se po své syntéze dostávají do měchýřků pod plazmatickou membránou, fúzí membrán dojde k sekreci do mimobuněčného prostoru (exocytóze)

• Význam rozpustnosti signální molekuly
• 

• proteiny
• krátké peptidy
• aminokyseliny
• nukleotidy
• steroidy
• retinoidy
• mastné kyseliny a jejich deriváty
• plyny

• steroidní / tyroidní hormony
• nízká molekulová hmotnost, hydrofobicita

• Malá velikost/lipofilní povaha hormonů
• ⇓
• difúze membránou
• ⇓
• pevná vazba na nitrobuněčné receptory
• ⇓
• konformační změna receptorů
• ⇓
• zvýšená afinita ke specifickým sekvencím DNA
• ⇓
• regulace transkripce cílových genů

• C-konec: doména pro vazbu hormonu
• N-konec: doména pro řízení transkripce
• Střed molekuly: doména pro vazbu DNA

• 1. Hydrofilní mimobuněčný signál (ligand, „primary messenger“)
• 2. Povrchový receptor
• 3. Sekundární přenašeč („secondary messenger“)
• 4. Cílová molekula (efektor)

růstový faktor, cytokin, hormon, atd.

převod mimobuněčného ligandu do podoby nitrobuněčného signálu

• nízkomolekulární struktury (cAMP, Ca2+, diacylglycerol, zbytek kyseliny fosforečné, atd.)
• produkt enzymově katalyzované reakce
• Fce: přenos signálu od povrchových receptorů k efektorům

• enzym
• složka replikačního aparátu
• složka aparátu pro genovou expresi
• složka cytoskeletu

• 1. Konformační změnou
• vyvolanou vazbou ligandu, která se projeví v nitrobuněčné doméně receptoru
• typické pro receptory se sedminásobným vinutím membránou
• 2. Dimerizací
• ligand seskupí inaktivní podjednotky receptorů, které jsou schopny laterálního pohybu membránou
• dimerizace receptoru umožní přiblížení jejich tyrozinkinázových cytoplazmatických domén
• následkem je vzájemná fosforylace a aktivace receptoru

• aktivace ligandem vede k vytvoření vazebného místa pro protein G (v cytoplazmatické části receptoru)
• aktivní receptor může interagovat s proteinem G- vazba vyvolá disociaci GDP z G proteinu a jeho nahrazení GTP
• aktivované receptory katalyzují výměnu nukleotidu vázaného k proteinu G
• aktivní G-protein s navázaným GTP reguluje několik důležitých enzymů zodpovědných za tvorbu sekundárních přenašečů

• trimerní (velké) G proteiny, které se indukují přímou vazbou s receptory
• monomerní (malé) G proteiny typu Ras, které interagují s receptory nepřímo prostřednictvím adaptérů

• všechny stimulované G proteiny obsahují oblasti, které interagují s jinými proteiny a tak ovlivňují jejich aktivitu
• všechny G proteiny mohou vázat GTP/GDP a disponují GTPázovou aktivitou

• spojovací články mezi povrchovými receptory a sekundárními přenašeči
• interagují pouze s aktivovanými receptory
• interakce s aktivovaným receptorem vede k výměně GDP na podjednotce α proteinu G za GTP
• podjednotka α s navázaným GTP se aktivuje a odděluje se od podjednotek β a γ
• uvolněná podjednotka α s navázaným GTP (podobně jako uvolněné podjednotky β a γ) může interagovat se svou cílovou molekulou v plazmatické membráně (efektorem), který signál předává dál

značná rozmanitost efektorů G proteinů (adenylát cykláza, fosfolipáza C, cGMP fosfodiesteráza, různé typy iontových kanálků)

• následná tvorba dalších signálních molekul
• nejčastějšími cílovými enzymy jsou adenylátcykláza (tvorba cAMP) a fosfolipáza C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu )
• spřažení mezi G-proteinem a tvorbou sekundárních přenašečů může být stimulační (Gs) nebo inhibiční (Gi)

• Regulace tvorby cyklického adenozimnonofosfátu (cAMP)
• (cAMP objeven při studiu metabolismu glykogenu, Sutherland, 1958)

• aktivit adenylátcyklázy + cAMP-fosfodiesterázy
• adenylát cyklázy regulována proteinem G, aktivita cAMP-fosfodiesterázy nepodléhá kontrole (je konstitutivní)
• rozpustnost ve vodě umožňuje přenos cAMP od membrány k proteinům cytozolu nebo jádra
• aktivuje cAMP-dependentní protein kinázu (kinázu A)
• 

• Protein kináza A
• aktivována cAMP
• fosforyluje transkripční faktor CREB (zodpovídající za transkripci genů vybavených sekvencí CRE – „cAMP-response element“)
• v metabolismu glykogenu fosforyluje fosforylázovou kinázu (aktivace štěpení glykogenu) a glykogensyntázu (inaktivace syntézy glykogenu)

• cAMP a metabolismus glykogenu
• 

• Inaktivní stav:
• dvě regulační podjednotky (vazba cAMP)
• dvě katalytické podjednotky
• Aktivní stav:
• vazba cAMP – změna konformace regulačních podjednotek – disociace regulačních podjednotek z komplexu – uvolněné katalytické podjednotky mohou fosforylovat své substráty

• PKA:
• výskyt ve všech živočišných buňkách
• zprostředkovává většinu účinků cAMP

• G-protein ovlivňuje hladinu iontů Ca2+ v cytozolu - G protein otvírá kanálky Ca2+
• koncentrace Ca2+ v cytozolu a mimobuněčném prostoru není stejná 
• cytozol: 10-7M,
• mimobuněčný prostor: 10-3M
• důsledek aktivní činnosti iontových pump na membránách
• koncentrační gradient tlačí ionty Ca2+ do cytozolu
• zvýšená permeabilita membrány – vyšší koncentrace Ca2+ v cytozolu – aktivace nitrobuněčného signálního mechanismu

• vazba ligandu k receptoru
• ⇓
• aktivace proteinu G = aktivace fosfolipázy C
• ⇓
• tvorba inozitol trifosfátu a diacylglycerolu 
• ⇓
• IP3 opouští plazmatickou membránu a difunduje cytozolem
• ⇓
• otevře kanálky Ca2+ v ER
• ⇓
• uvolnění Ca2+

• Troponin C
• přítomen v buňkách kosterního svalstva
• úloha při svalové kontrakci

• Kalmodulin
• protein zprostředkující většinu reakcí na Ca2+

• vazba Ca2+ na kalmodulin
• ⇓
• změna konformace
• ⇓
• zvýšení afinity pro jiné proteiny
• ⇓
• změna jejich aktivity 

kalmodulin bývá stálou regulační složkou enzymových komplexů

důležitou cílovou molekulou řízenou komplexy kalmodulin/Ca2+ je Ca2+-dependentní protein kináza (Ca-kináza), která fosforyluje Ser/Thr cílových proteinů

• ^{proteinkinázová aktivita je vázaná na přítomnost ligandu}
• zajištění odpovědi buňky na růstové faktory
• receptorovou úlohu má glykozylovaná N-koncová doména
• středová hydrofobní doména prochází membránou
• C-koncová doména má kinázovou aktivitu nebo je schopna asociovat s nitrobuněčnými kinázami – určuje typ signální dráhy a charakter buněčné odpovědi

• cytoplazmatická doména má tyrozinkinázovou aktivitu závislou na vazbě ligandu k mimobuněčné doméně
• většinou jediný polypeptidový řetězec, který prochází membránou šroubovicovou doménou (možnost laterální difúze membránou)
• vazba ligandu vyvolá dimerizaci podjednotek receptoru, což vede k transfosforylaci partnerské podjednotky- následkem je aktivace receptorové kinázy

K fosforylovaným AK zbytkům se doménami SH2 váže řada různých proteinů

spojuje receptorové PTK s nitrobuněčnými přenašeči

• první část: receptor-Grb2-Sos-Ras
• druhá část: Ras-Raf-MEK-ERK-ELK1

• Ras aktivuje dráhu MAPK
• Růstové faktory prostřednictvím dráhy Ras/MAPK zapínají expresi genů nutných pro růst a dělení

• první část: receptor-Grb2-Sos-Ras
• Grb2 je adaptérový protein s doménami SH2 a SH3
• doména SH2 proteinu Grb2 se spojuje s aktivovanou receptorovou PTK
• doména SH3 spojuje Grb2 s proteinem Sos
• Sos je GEF protein - zajišťuje výměnu GDP za GTP na proteinu Ras (aktivace Ras)
• 

• druhá část: Ras-Raf-MEK-ERK-ELK1
• aktivovaný Ras váže a aktivuje své efektory, např. Raf
• Raf je serin-treonin kináza, která spouští kaskádu kináz MAP (mitogenactivated protein kinases): Raf aktivuje MEK, MEK aktivuje ERK
• ERK přechází do jádra, kde aktivuje Elk-1
• Elk-1 je transkripční faktor indukující transkripci proliferačních genů

• rodina serin/treonin PTK
• ^{vysoká konzervativnost v eukaryontních buňkách}
• účast na procesech proliferace, diferenciace, pohybu a buněčné smrti

• MAPK (ERK) jsou fosforylovány a aktivovány MAPK-kinázami (MAPKK)
• MAPKK (MEK) jsou fosforylovány a aktivovány MAPKK-kinázami (MAPKKK)
• MAPKKK (RAF) jsou aktivovány interakcí s malými G proteiny (např. Ras) nebo jinými kinázami, které jsou napojeny na povrchové receptory

• Mutantní Ras v nádorových buňkách nemůže hydrolyzovat GTP a hromadí se v aktivním stavu
•