09b Buněčná smrt, drahy

• receptorová (vnější) se aktivuje vazbou ligandů smrti na příslušné membránové receptory
• mitochondriální (vnitřní) se aktivuje změnou permeability vnější mitochondriální membrány
• 

mitochondrie a cytochrom c obsažený v prostoru mezi vnější a vnitřní membránou

• translokace cytochromu c do cytozolu
• 

• běžně přítomen v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrie 
• podíl na transportu elektronů při oxidativní fosforylaci

Apaf-1 („apoptotic protease activating factor“)

• 1. cytochrom c permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu
• 2. váže se na Apaf-1 („apoptotic protease
• activating factor“)
• 3. Apaf-1 mění konformaci-umožnění vazby dATP
• 4. vazbou dATP se konformace Apaf-1 dále
• mění - obnažení oligomerizační domény
• 5. 7 molekul Apaf-1 se spojuje-vzniká apoptozom

apoptozom váže iniciační prokaspázu 9

• apoptozom váže iniciační prokaspázu 9
• molekuly prokaspázy 9 se v apoptozomu dostávají do těsné blízkosti, což vede k jejich aktivaci
• kaspáza 9 aktivuje exekuční kaspázy 3 a 7
• 

• cytochrom c uvolněný z mitochondrií do cytozolu se váže na Apaf-1
• Apaf-1/cytochrom c díky dATP mění konformaci a oligomerizuje („apoptozom“)
• apoptozom váže a aktivuje prokaspázu 9
• aktivovaná kaspáza 9 aktivuje další kaspázy zodpovídající za apoptotickou smrt buňky (kaspázy 3 nebo 7)

• 
• aktivace kaspáz

• proteiny rodiny Bcl-2
• poměr anti-apoptotických („pro-survival“) a pro-apoptotických vzájemně heterodimerizujících proteinů rozhoduje o propustnosti mitochondriální membrány pro cytochrom c

• prostřednictvím domény BH homodimerizují nebo heterodimerizují
• homodimery Bax indukují apoptózu
• Bcl-2 tvoří s proteinem Bax heterodimery, čímž jeho proapoptotickou aktivitu inhibují
• poměry faktorů „pro-death“ a „pro-survival“ rodiny Bcl-2 rozhodují o smrti buněk

• pro-apoptotické signály způsobují depolarizaci vnější mitochondriální membrány a sestavení takových dimerů z proteinů rodiny Bcl-2, které usnadňují přenos cytochromu c membránou do cytozolu, kde se spojuje s dalšími proteiny a spouští kaskádu reakcí vedoucí k apoptóze
• anti-apoptotické signály vedou k sestavování takových komplexů rodiny Bcl-2, které uvolnění cytochromu c mimo mitochondrie neumožňují
• 

aktivovaná vnějšími („death“) ligandy

• aktivovaná vnějšími („death“) ligandy
• registrace ligandů povrchovými receptory Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)
• receptory po aktivaci tvoří trimery
• dva nebo tři trimery se prostřednictvím ligandů propojují
• nitrobuněčné domény těchto receptorů se tím aktivují – jsou schopny interakce s dalšími proteiny – např. adaptérovým proteinem FADD
• FADD je následně schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace
• dimeriace aktivuje kaspázu 8, která tak může aktivovat exekuční kaspázy

Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)

adaptérový protein, který intereaguje s nitrobuněčnými doménami receptorů Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF) a následně je schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace

• transmembránové proteiny schopné vyvolat apoptózu
• napojují se na vnitřní kaspázovou signalizaci

• ^{poškození DNA, nedostatek růstových faktorů a další stresové podněty mohou indukovat apoptózu pomocí proteinu p53}
• p53
• aktivuje expresi bax, který kóduje pro-apoptotický protein uvolňující cytochrom c z mitochondrií (aktivace kaspáz)
• posiluje expresi receptoru Fas
• blokuje anti-apoptotickou dráhu řízenou IGF (Insulin-like growth factor)

• oba proteiny uvolňovány cytotoxickými T-buňkami
• Perforin:
• tvorba transmembránových pórů pro zajištění průniku granzymu do buňky
• Granzym B:
• - štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3)
• - štěpení inhibitoru ICAD

• Změny v plazmatické membráně
• Změny v mitochondriální membráně
• Změny v cytoplazmě
• Změny jádře

• 1. translokace fosfatidylserinu z vnitřní do vnější vrstvy – znak rané apoptózy
• 2. detekce proteinem Annexin V, který se k fosfatidylserinu váže
• 3. označení Annexinu V fluoreskující značkou - detekce fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií
• ^{nekrotické buňky mohou poskytovat falešnou pozitivitu díky poškození membrán - lze eliminovat současným barvením DNA (např. propidium jodidem – „double-staining“)}

• snížený membránový potenciál – znak rané apoptózy
• lze detekovat sondou TMRE (tetrametylrodamin, etyl ester), což je barvivo, které proniká do buněk a váže se na mitochondrie
• u mitochondrií v apoptotických buňkách se sníženým membránovým potenciálem je vazebná schopnost TMRE snížena
• obvyklá detekce – průtokovou cytometrií
• lze stanovit i uvolněné mitochondriální proteiny (např. cytochrom c)

• FCCP indukuje permeabilizaci mitochondriální membrány
• 

• aktivace kaspáz
• detekce pomocí specifických kaspázových substrátů, např. PARP nebo cytokeratin
• detekce pomocí protilátek zaměřených na epitopy, které se obnažují po štěpení kaspázami nebo přímo degradaci substrátů – např. westernovým přenosem nebo průtokovou cytometrií

• kondenzace chromatinu
• fragmentaci DNA (dvouřetězcové zlomy mezi nukleozomy) lze detekovat gelovou elektroforézou nebo technikou TUNEL
• TUNEL (terminal deoxy-nucleotidyltransferase dUTP nick end labelling) assay
• zlomy DNA jsou označeny enzymem TdT, které se pak stanovují protilátkami (imunohistochemicky nebo průtokovou cytometrií)

• rozlišit živé buňky od mrtvých
• zhodnotit míru emitované fluorescence každou jednotlivou buňkou
• frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s mírou fluorescence
• vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu

• Účel: Studium vlastností individuálních buněk v buněčné populaci
• míra přítomnosti určitých antigenů (např. sledování diferenciace buněk)
• míra přítomnosti DNA (např. sledování buněčného cyklu, apoptózy)
• velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (určení buněčných typů ve směsích buněk)
• možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorter)

• Princip: Počítačové zpracování míry emitované fluorescence jednotlivých buněk
• Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru (antigen, DNA…)

• „Flow cytometry“ - měření určité vlastnosti buněk v průběhu jejich toku přístrojem
• „Flow sorting“ (Fluorescence-activated cell sorting FACS) oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v průběhu průtokové cytometrie

• 1. koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA - propidium jodid, pro protein - fluoreskující protilátka)
• 2. buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z nich obsahuje jednu buňku)
• 3. jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem - dojde k excitaci fluorescenční značky a emisi fluorescence
• 4. měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru přítomnosti cílové molekuly)
• 5. měření míry rozptylu světla pro každou buňku (určuje míru granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky)

• Princip:
• podle míry fluorescence je každé kapičce s jednotlivou buňkou udělen proporcionální elektrický náboj
• kapičky procházejí prostorem mezi dvěma elektrodami a dochází k jejich frakcionaci podle náboje

• buňky nejsou průtokovou cytometrií poškozeny - udržují si životaschopnost
• buňky nejsou kontaminovány - lze je dále kultivovat

• Princip:
• měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách, který se v průběhu cyklu periodicky mění
• Postup:
• obarvení DNA fluorescenčním barvivem - propidium jodidem
• měření míry fluorescence emitované jednotlivými buňkami
• počítačové zpracování dat a grafické vyhodnocení

• Princip:
• buňky se ošetří 70% etanolem a poškozenou membránou uniká fragmentovaná DNA
• fragmentovaná DNA po obarvení propidium jodidem fluoreskuje v oblasti subG1)