-
jmenuj Signální dráhy apoptózy
- receptorová (vnější) se aktivuje vazbou ligandů smrti na příslušné membránové receptory
- mitochondriální (vnitřní) se aktivuje změnou permeability vnější mitochondriální membrány

-
hlavním elementem Vnitřní (mitochondriální) dráhy jsou...
mitochondrie a cytochrom c obsažený v prostoru mezi vnější a vnitřní membránou
-
kritickou událostí mitochondriální dráhy je...
- translokace cytochromu c do cytozolu

-
Cytochrom c je běžně přítomen v prostoru mezi ... a jeho hlavní funkcí je ...
- běžně přítomen v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrie
- podíl na transportu elektronů při oxidativní fosforylaci
-
cytochrom c permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu, kde se váže na ...
Apaf-1 („apoptotic protease activating factor“)
-
popiš proces, kterým vzniká apoptozom
- 1. cytochrom c permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu
- 2. váže se na Apaf-1 („apoptotic protease
- activating factor“)
- 3. Apaf-1 mění konformaci-umožnění vazby dATP
- 4. vazbou dATP se konformace Apaf-1 dále
- mění - obnažení oligomerizační domény
- 5. 7 molekul Apaf-1 se spojuje-vzniká apoptozom
-
apoptozom váže který enzym?
apoptozom váže iniciační prokaspázu 9
-
jak dochází k aktivaci prokaspázy 9 a následné apoptóze?
- apoptozom váže iniciační prokaspázu 9
- molekuly prokaspázy 9 se v apoptozomu dostávají do těsné blízkosti, což vede k jejich aktivaci
- kaspáza 9 aktivuje exekuční kaspázy 3 a 7

-
popiš sled událostí, které vedou k apoptóze buňky prostřednictvím apoptozomu
- cytochrom c uvolněný z mitochondrií do cytozolu se váže na Apaf-1
- Apaf-1/cytochrom c díky dATP mění konformaci a oligomerizuje („apoptozom“)
- apoptozom váže a aktivuje prokaspázu 9
- aktivovaná kaspáza 9 aktivuje další kaspázy zodpovídající za apoptotickou smrt buňky (kaspázy 3 nebo 7)
- aktivace kaspáz
-
Co rozhoduje o uvolnění cytochromu c?
- proteiny rodiny Bcl-2
- poměr anti-apoptotických („pro-survival“) a pro-apoptotických vzájemně heterodimerizujících proteinů rozhoduje o propustnosti mitochondriální membrány pro cytochrom c
-
jaké typy dimerů tvoří Proteiny Bcl-2?
- prostřednictvím domény BH homodimerizují nebo heterodimerizují
- homodimery Bax indukují apoptózu
- Bcl-2 tvoří s proteinem Bax heterodimery, čímž jeho proapoptotickou aktivitu inhibují
- poměry faktorů „pro-death“ a „pro-survival“ rodiny Bcl-2 rozhodují o smrti buněk
-
charakterizuj vliv pro- a anti-apoptických signálů na rodinu Bcl-2
- pro-apoptotické signály způsobují depolarizaci vnější mitochondriální membrány a sestavení takových dimerů z proteinů rodiny Bcl-2, které usnadňují přenos cytochromu c membránou do cytozolu, kde se spojuje s dalšími proteiny a spouští kaskádu reakcí vedoucí k apoptóze
- anti-apoptotické signály vedou k sestavování takových komplexů rodiny Bcl-2, které uvolnění cytochromu c mimo mitochondrie neumožňují

-
Vnější (receptorová) dráha je aktivována ...
aktivovaná vnějšími („death“) ligandy
-
na jakém principu funguje Vnější (receptorová) dráha?
- aktivovaná vnějšími („death“) ligandy
- registrace ligandů povrchovými receptory Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)
- receptory po aktivaci tvoří trimery
- dva nebo tři trimery se prostřednictvím ligandů propojují
- nitrobuněčné domény těchto receptorů se tím aktivují – jsou schopny interakce s dalšími proteiny – např. adaptérovým proteinem FADD
- FADD je následně schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace
- dimeriace aktivuje kaspázu 8, která tak může aktivovat exekuční kaspázy
-
jak se jmenují receptory vnější dráhy?
Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)
-
co je to protein FADD?
adaptérový protein, který intereaguje s nitrobuněčnými doménami receptorů Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF) a následně je schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace
-
definuj Receptory smrti
- transmembránové proteiny schopné vyvolat apoptózu
- napojují se na vnitřní kaspázovou signalizaci
-
jak se na apoptóze podílí p53?
- poškození DNA, nedostatek růstových faktorů a další stresové podněty mohou indukovat apoptózu pomocí proteinu p53
- p53
- aktivuje expresi bax, který kóduje pro-apoptotický protein uvolňující cytochrom c z mitochondrií (aktivace kaspáz)
- posiluje expresi receptoru Fas
- blokuje anti-apoptotickou dráhu řízenou IGF (Insulin-like growth factor)
-
jakou roli mají perforin a granzym B?
- oba proteiny uvolňovány cytotoxickými T-buňkami
- Perforin:
- tvorba transmembránových pórů pro zajištění průniku granzymu do buňky
- Granzym B:
- - štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3)
- - štěpení inhibitoru ICAD
-
jmenuj Metody detekce apoptózy jsou založeny na pozorování změn v jakých strukturách?
- Změny v plazmatické membráně
- Změny v mitochondriální membráně
- Změny v cytoplazmě
- Změny jádře
-
Metody detekce apoptózy: Změny v plazmatické membráně
- 1. translokace fosfatidylserinu z vnitřní do vnější vrstvy – znak rané apoptózy
- 2. detekce proteinem Annexin V, který se k fosfatidylserinu váže
- 3. označení Annexinu V fluoreskující značkou - detekce fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií
- nekrotické buňky mohou poskytovat falešnou pozitivitu díky poškození membrán - lze eliminovat současným barvením DNA (např. propidium jodidem – „double-staining“)
-
Metody detekce apoptózy: Změny v mitochondriální membráně
- snížený membránový potenciál – znak rané apoptózy
- lze detekovat sondou TMRE (tetrametylrodamin, etyl ester), což je barvivo, které proniká do buněk a váže se na mitochondrie
- u mitochondrií v apoptotických buňkách se sníženým membránovým potenciálem je vazebná schopnost TMRE snížena
- obvyklá detekce – průtokovou cytometrií
- lze stanovit i uvolněné mitochondriální proteiny (např. cytochrom c)
- FCCP indukuje permeabilizaci mitochondriální membrány

-
Metody detekce apoptózy: Změny v cytoplazmě
- aktivace kaspáz
- detekce pomocí specifických kaspázových substrátů, např. PARP nebo cytokeratin
- detekce pomocí protilátek zaměřených na epitopy, které se obnažují po štěpení kaspázami nebo přímo degradaci substrátů – např. westernovým přenosem nebo průtokovou cytometrií
-
Metody detekce apoptózy: Změny jádře
- kondenzace chromatinu
- fragmentaci DNA (dvouřetězcové zlomy mezi nukleozomy) lze detekovat gelovou elektroforézou nebo technikou TUNEL
- TUNEL (terminal deoxy-nucleotidyltransferase dUTP nick end labelling) assay
- zlomy DNA jsou označeny enzymem TdT, které se pak stanovují protilátkami (imunohistochemicky nebo průtokovou cytometrií)
-
co dokáže Průtoková cytometrie?
- rozlišit živé buňky od mrtvých
- zhodnotit míru emitované fluorescence každou jednotlivou buňkou
- frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s mírou fluorescence
- vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu
- Účel: Studium vlastností individuálních buněk v buněčné populaci
- míra přítomnosti určitých antigenů (např. sledování diferenciace buněk)
- míra přítomnosti DNA (např. sledování buněčného cyklu, apoptózy)
- velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (určení buněčných typů ve směsích buněk)
- možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorter)
-
na jakém principu funguje Průtoková cytometrie? jaký je předpoklad pro funkčnost této metody?
- Princip: Počítačové zpracování míry emitované fluorescence jednotlivých buněk
- Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru (antigen, DNA…)
-
objasni pojmy Flow cytometry + Flow sorting
- „Flow cytometry“ - měření určité vlastnosti buněk v průběhu jejich toku přístrojem
- „Flow sorting“ (Fluorescence-activated cell sorting FACS) oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v průběhu průtokové cytometrie
-
popiš postup Průtokové cytometrie
- 1. koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA - propidium jodid, pro protein - fluoreskující protilátka)
- 2. buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z nich obsahuje jednu buňku)
- 3. jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem - dojde k excitaci fluorescenční značky a emisi fluorescence
- 4. měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru přítomnosti cílové molekuly)
- 5. měření míry rozptylu světla pro každou buňku (určuje míru granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky)
-
jaký je princip Frakcionace buněk - FACS?
- Princip:
- podle míry fluorescence je každé kapičce s jednotlivou buňkou udělen proporcionální elektrický náboj
- kapičky procházejí prostorem mezi dvěma elektrodami a dochází k jejich frakcionaci podle náboje
-
jaké výhody přináší Frakcionace buněk - FACS?
- buňky nejsou průtokovou cytometrií poškozeny - udržují si životaschopnost
- buňky nejsou kontaminovány - lze je dále kultivovat
-
popiš Využití průtokové cytometrie pro analýzu buněčného cyklu
- Princip:
- měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách, který se v průběhu cyklu periodicky mění
- Postup:
- obarvení DNA fluorescenčním barvivem - propidium jodidem
- měření míry fluorescence emitované jednotlivými buňkami
- počítačové zpracování dat a grafické vyhodnocení
-
popiš Využití průtokové cytometrie pro analýzu fragmentace DNA
- Princip:
- buňky se ošetří 70% etanolem a poškozenou membránou uniká fragmentovaná DNA
- fragmentovaná DNA po obarvení propidium jodidem fluoreskuje v oblasti subG1)
|
|