09b Buněčná smrt, drahy

  1. jmenuj Signální dráhy apoptózy
    • receptorová (vnější) se aktivuje vazbou ligandů smrti na příslušné membránové receptory
    • mitochondriální (vnitřní) se aktivuje změnou permeability vnější mitochondriální membrány
    • Image Upload 1
  2. hlavním elementem Vnitřní (mitochondriální) dráhy jsou...
    mitochondrie a cytochrom c obsažený v prostoru mezi vnější a vnitřní membránou

    Image Upload 2
  3. kritickou událostí mitochondriální dráhy je...
    • translokace cytochromu c do cytozolu
    • Image Upload 3
  4. Cytochrom c je běžně přítomen v prostoru mezi ... a jeho hlavní funkcí je ...
    • běžně přítomen v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrie 
    • podíl na transportu elektronů při oxidativní fosforylaci
  5. cytochrom c permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu, kde se váže na ...
    Apaf-1 („apoptotic protease activating factor“)
  6. popiš proces, kterým vzniká apoptozom
    • 1. cytochrom c permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu
    • 2. váže se na Apaf-1 („apoptotic protease
    • activating factor“)
    • 3. Apaf-1 mění konformaci-umožnění vazby dATP
    • 4. vazbou dATP se konformace Apaf-1 dále
    • mění - obnažení oligomerizační domény
    • 5. 7 molekul Apaf-1 se spojuje-vzniká apoptozom

    Image Upload 4
  7. apoptozom váže který enzym?
    apoptozom váže iniciační prokaspázu 9
  8. jak dochází k aktivaci  prokaspázy 9 a následné apoptóze?
    • apoptozom váže iniciační prokaspázu 9
    • molekuly prokaspázy 9 se v apoptozomu dostávají do těsné blízkosti, což vede k jejich aktivaci
    • kaspáza 9 aktivuje exekuční kaspázy 3 a 7
    • Image Upload 5
  9. popiš sled událostí, které vedou k apoptóze buňky prostřednictvím apoptozomu
    • cytochrom c uvolněný z mitochondrií do cytozolu se váže na Apaf-1
    • Apaf-1/cytochrom c díky dATP mění konformaci a oligomerizuje („apoptozom“)
    • apoptozom váže a aktivuje prokaspázu 9
    • aktivovaná kaspáza 9 aktivuje další kaspázy zodpovídající za apoptotickou smrt buňky (kaspázy 3 nebo 7)

    • Image Upload 6
    • aktivace kaspáz
  10. Co rozhoduje o uvolnění cytochromu c?
    • proteiny rodiny Bcl-2
    • poměr anti-apoptotických („pro-survival“) a pro-apoptotických vzájemně heterodimerizujících proteinů rozhoduje o propustnosti mitochondriální membrány pro cytochrom c

    Image Upload 7
  11. jaké typy dimerů tvoří Proteiny Bcl-2?
    • prostřednictvím domény BH homodimerizují nebo heterodimerizují
    • homodimery Bax indukují apoptózu
    • Bcl-2 tvoří s proteinem Bax heterodimery, čímž jeho proapoptotickou aktivitu inhibují
    • poměry faktorů „pro-death“ a „pro-survival“ rodiny Bcl-2 rozhodují o smrti buněk

    Image Upload 8
  12. charakterizuj vliv pro- a anti-apoptických signálů na rodinu Bcl-2
    • pro-apoptotické signály způsobují depolarizaci vnější mitochondriální membrány a sestavení takových dimerů z proteinů rodiny Bcl-2, které usnadňují přenos cytochromu c membránou do cytozolu, kde se spojuje s dalšími proteiny a spouští kaskádu reakcí vedoucí k apoptóze
    • anti-apoptotické signály vedou k sestavování takových komplexů rodiny Bcl-2, které uvolnění cytochromu c mimo mitochondrie neumožňují
    • Image Upload 9
  13. Vnější (receptorová) dráha je aktivována ...
    aktivovaná vnějšími („death“) ligandy
  14. na jakém principu funguje Vnější (receptorová) dráha?
    • aktivovaná vnějšími („death“) ligandy
    • registrace ligandů povrchovými receptory Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)
    • receptory po aktivaci tvoří trimery
    • dva nebo tři trimery se prostřednictvím ligandů propojují
    • nitrobuněčné domény těchto receptorů se tím aktivují – jsou schopny interakce s dalšími proteiny – např. adaptérovým proteinem FADD
    • FADD je následně schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace
    • dimeriace aktivuje kaspázu 8, která tak může aktivovat exekuční kaspázy

    Image Upload 10
  15. jak se jmenují receptory vnější dráhy?
    Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF)
  16. co je to protein FADD?
    adaptérový protein, který intereaguje s nitrobuněčnými doménami receptorů Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF) a následně je schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace
  17. definuj Receptory smrti
    • transmembránové proteiny schopné vyvolat apoptózu
    • napojují se na vnitřní kaspázovou signalizaci

    Image Upload 11
  18. jak se na apoptóze podílí  p53?
    • poškození DNA, nedostatek růstových faktorů a další stresové podněty mohou indukovat apoptózu pomocí proteinu p53
    • p53
    • aktivuje expresi bax, který kóduje pro-apoptotický protein uvolňující cytochrom c z mitochondrií (aktivace kaspáz)
    • posiluje expresi receptoru Fas
    • blokuje anti-apoptotickou dráhu řízenou IGF (Insulin-like growth factor)

    Image Upload 12
  19. jakou roli mají perforin a granzym B?
    • oba proteiny uvolňovány cytotoxickými T-buňkami
    • Perforin:
    • tvorba transmembránových pórů pro zajištění průniku granzymu do buňky
    • Granzym B:
    • - štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3)
    • - štěpení inhibitoru ICAD

    Image Upload 13

    Image Upload 14
  20. jmenuj Metody detekce apoptózy jsou založeny na pozorování změn v jakých strukturách?
    • Změny v plazmatické membráně
    • Změny v mitochondriální membráně
    • Změny v cytoplazmě
    • Změny jádře
  21. Metody detekce apoptózy: Změny v plazmatické membráně
    • 1. translokace fosfatidylserinu z vnitřní do vnější vrstvy – znak rané apoptózy
    • 2. detekce proteinem Annexin V, který se k fosfatidylserinu váže
    • 3. označení Annexinu V fluoreskující značkou - detekce fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií
    • nekrotické buňky mohou poskytovat falešnou pozitivitu díky poškození membrán - lze eliminovat současným barvením DNA (např. propidium jodidem – „double-staining“)

    Image Upload 15

    Image Upload 16
  22. Metody detekce apoptózy: Změny v mitochondriální membráně
    • snížený membránový potenciál – znak rané apoptózy
    • lze detekovat sondou TMRE (tetrametylrodamin, etyl ester), což je barvivo, které proniká do buněk a váže se na mitochondrie
    • u mitochondrií v apoptotických buňkách se sníženým membránovým potenciálem je vazebná schopnost TMRE snížena
    • obvyklá detekce – průtokovou cytometrií
    • lze stanovit i uvolněné mitochondriální proteiny (např. cytochrom c)

    • FCCP indukuje permeabilizaci mitochondriální membrány
    • Image Upload 17
  23. Metody detekce apoptózy: Změny v cytoplazmě
    • aktivace kaspáz
    • detekce pomocí specifických kaspázových substrátů, např. PARP nebo cytokeratin
    • detekce pomocí protilátek zaměřených na epitopy, které se obnažují po štěpení kaspázami nebo přímo degradaci substrátů – např. westernovým přenosem nebo průtokovou cytometrií

    Image Upload 18

    Image Upload 19
  24. Metody detekce apoptózy: Změny jádře
    • kondenzace chromatinu
    • fragmentaci DNA (dvouřetězcové zlomy mezi nukleozomy) lze detekovat gelovou elektroforézou nebo technikou TUNEL
    • TUNEL (terminal deoxy-nucleotidyltransferase dUTP nick end labelling) assay
    • zlomy DNA jsou označeny enzymem TdT, které se pak stanovují protilátkami (imunohistochemicky nebo průtokovou cytometrií)

    Image Upload 20

    Image Upload 21
  25. co dokáže Průtoková cytometrie?
    • rozlišit živé buňky od mrtvých
    • zhodnotit míru emitované fluorescence každou jednotlivou buňkou
    • frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s mírou fluorescence
    • vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu

    • Účel: Studium vlastností individuálních buněk v buněčné populaci
    • míra přítomnosti určitých antigenů (např. sledování diferenciace buněk)
    • míra přítomnosti DNA (např. sledování buněčného cyklu, apoptózy)
    • velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (určení buněčných typů ve směsích buněk)
    • možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorter)
  26. na jakém principu funguje Průtoková cytometrie? jaký je předpoklad pro funkčnost této metody?
    • Princip: Počítačové zpracování míry emitované fluorescence jednotlivých buněk
    • Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru (antigen, DNA…)
  27. objasni pojmy Flow cytometry + Flow sorting
    • Flow cytometry“ - měření určité vlastnosti buněk v průběhu jejich toku přístrojem
    • Flow sorting“ (Fluorescence-activated cell sorting FACS) oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v průběhu průtokové cytometrie
  28. popiš postup Průtokové cytometrie
    • 1. koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA - propidium jodid, pro protein - fluoreskující protilátka)
    • 2. buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z nich obsahuje jednu buňku)
    • 3. jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem - dojde k excitaci fluorescenční značky a emisi fluorescence
    • 4. měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru přítomnosti cílové molekuly)
    • 5. měření míry rozptylu světla pro každou buňku (určuje míru granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky)

    Image Upload 22
  29. jaký je princip Frakcionace buněk - FACS?
    • Princip:
    • podle míry fluorescence je každé kapičce s jednotlivou buňkou udělen proporcionální elektrický náboj
    • kapičky procházejí prostorem mezi dvěma elektrodami a dochází k jejich frakcionaci podle náboje

    Image Upload 23


    Image Upload 24
  30. jaké výhody přináší Frakcionace buněk - FACS?
    • buňky nejsou průtokovou cytometrií poškozeny - udržují si životaschopnost
    • buňky nejsou kontaminovány - lze je dále kultivovat
  31. popiš Využití průtokové cytometrie pro analýzu buněčného cyklu
    • Princip:
    • měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách, který se v průběhu cyklu periodicky mění
    • Postup:
    • obarvení DNA fluorescenčním barvivem - propidium jodidem
    • měření míry fluorescence emitované jednotlivými buňkami
    • počítačové zpracování dat a grafické vyhodnocení

    Image Upload 25
  32. popiš Využití průtokové cytometrie pro analýzu fragmentace DNA
    • Princip:
    • buňky se ošetří 70% etanolem a poškozenou membránou uniká fragmentovaná DNA
    • fragmentovaná DNA po obarvení propidium jodidem fluoreskuje v oblasti subG1)

    Image Upload 26
Author
iren
ID
347048
Card Set
09b Buněčná smrt, drahy
Description
molekularni biologie
Updated