07 Regulace genové exprese

• konstitutivní genová exprese = stabilní (průběžná) exprese genů, které kódují složky buněk nutné pro udržování základních - provozních funkcí ("housekeeping functions")
• provozní geny kódují např. rRNA, tRNA, ribozomové proteiny, RNA-polymerázy, strukturní proteiny, proteiny zapojené do sestřihu a proteosyntézy, atd.
• konstitutivní geny se exprimují ve většině buněk

• Proč regulovat expresi genů?
• ^{produkty všech genů genomu nejsou v každém okamžiku života buňky nezbytné}
• ^{proměnlivost prostředí}
• ^{proměnlivost buňky během buněčného cyklu}
• ^{energetická náročnost procesu genové exprese}

• zvyšuje se nebo snižuje podle potřeby
• týká se (inducibilních/represibilních) genů, jejichž produkty jsou potřebné pouze za určitých podmínek
• syntéza těchto genů je pod kontrolou speciálních regulačních systémů
• konstitutivní exprese těchto genů by znamenala zbytečnou energetickou zátěž buňky (evoluční výhoda)

• gen se exprimuje jen za přítomnosti aktivátoru, obvykle transkripčního faktoru, který napomáhá RNA-polymeráze ve vazbě na promotor – aktivita aktivátoru závisí na přijetí signálu
• signál mění konformaci inaktivního regulátoru do aktivního stavu, který tak získá schopnost vazby do regulační oblasti genu, což usnadní funkci RNA-polymeráze

• gen se exprimuje jen za nepřítomnosti represoru – pokud je represor přítomen, váže se na operátor a znemožní expresi daného genu - uvolnění represoru závisí na přijetí signálu
• regulátor blokuje promotor dokud nedojde vazbou signálu ke změně jeho konformace – čímž se uvolní z DNA a usnadní tak funkci RNA-polymeráze

• induktoru, který se váže k regulačnímu proteinu
• ^{signálů ovlivňujících expresi určitého genu může být větší počet}
• aktivátory: proteiny, které posilují expresi
• z určitých promotorů
• represory: proteiny, které tlumí expresi z určitých promotorů

transkripce

z hlediska zajištění rychlosti je výhodné zajistit produkci proteinu v inaktivní formě a možnosti jeho rychlého převedení do aktivního stavu

• 
  heterochromatizace/euchromatizace
• 
  transkripce vedoucí ke vzniku primárního transkriptu
• 
  úpravy primárního transkriptu vedoucí ke vzniku zralé mRNA
• 
  stabilita mRNA, její náchylnost/odolnost k degradaci
• 
  translace mRNA vedoucí k vzniku polypeptidových řetězců
• 
  úpravy a sestavování polypeptidových řetězců
• 
  regulace aktivity proteinu
• 
  regulace degradace proteinu
• 
  regulace translokace proteinu
• 

• konstitutivní
• 
  vždy kondenzovaný
• 
  lokalizace v blízkosti centromery a na koncích chromozomu
• 
  nepřístupný genové expresi
• fakultativní
• 
  převoditelý na euchromatin modifikacemi histonů (acetylace, fosforylace, ADP-ribozylace, ubikvitinace) a tím zpřístupněn genové expresi

translokace

• 
  u jednobuněčných: reakce na změny okolí (teplota, osmotický tlak, dostupnost živin, atd.)
• 
  u mnohobuněčných: reakce na změny okolí + komunikace mezi buňkami téhož organismu + vývojové procesy v rámci organismu

• 1. řídí genovou expresi v reakci na změny okolí
• poskytují metabolismu plasticitu - dosažení maximálního růstu a reprodukce za nejrůznějších podmínek
• 2. předprogramované okruhy nebo kaskády genové exprese
• podnět ovlivní expresi určitého genu, jehož produkt ovlivní expresi sady dalších genů, jejich produkty zase další, atd.

• trans-aktivačních molekul s cis-aktivačními sekvencemi
• trans-aktivační molekuly (obvykle proteiny); jsou schopny opustit místo své syntézy a volně se pohybovat, aby si našly svou cílovou molekulu
• cis-aktivační elementy (obvykle sekvence DNA); fungují výlučně jako sekvence, které neopouštějí molekulu, jejíž jsou součástí (např. promotory, terminátory)

• strukturní gen kóduje jakýkoliv protein bez regulační funkce
• regulátorový gen kóduje takový protein (nebo RNA), který se zapojuje do procesu regulace genové exprese
• ^{Regulátorový protein může genovou expresi zapnout nebo vypnout}
• 

• sigma faktor umožňuje RNA-polymeráze specifickou vazbu na promotor
• několik skupin genů má promotory bez typických sekvencí -35 a -10: rozeznávány alternativními sigma faktory
• každý alternativní sigma faktor zajišťuje expresi celých skupin genů (50 a více), jejichž produkty jsou zapotřebí za určitých podmínek (např. stacionární fáze růstu, nedostatek dusíku, atd.)

Alternativní sigma faktory se uplatňují při sporulaci

• spóry se tvoří asymetrickým dělením mateřské buňky za nepříznivých podmínek
• primitivní forma diferenciace prokaryotických buněk
• tvorba spór je řízena čtyřmi alternativními sigma faktory
• mezi geny rozeznávanými jedním sigma faktorem jsou i geny kódující jiné sigma faktory
• 

• proteiny, které vážou sigma faktory a tím je inhibují- ztratí schopnost vazby na RNA- polymerázu
• anti-anti sigma faktory se podílejí na regulační kaskádě
• 

• v blízkosti promotoru je další „cis-element“ - operátor
• operátor je místo vazby pro represor

• operátor je místo vazby pro represor
• vazba represoru na operátor brání RNA-polymeráze iniciovat transkripci - Negativní kontrola
• exprese genu vypnuta
• běžné u bakterií

• pro iniciaci transkripce je nutný transkripční faktor, který asistuje RNA-polymeráze
• bez pozitivního signálu je gen inaktivní, RNA-polymeráza nemůže iniciovat transkripci

• bakterie reagují rychle na změny svého okolí
• změny v dostupnosti klíčových živin mohou nastat kdykoliv, rychlé přepnutí metabolismu je podmínkou přežití
• produkce nepotřebného enzymu je zbytečná zátěž
• bakterie netvoří enzymy pro zpracování substrátu, pokud tento není k dispozici, ale jsou připraveny jejich produkci nastartovat, pokud se substrát objeví

využitelné jsou různé cukry, E. coli preferuje glukózu

• β-galaktozidázy a β-galaktozidpermeázy
• za nepřítomnosti laktózy v okolí, buňky E. coli tyto enzymy nesyntetizují
• exprese obou genů je za nepřítomnosti glukózy a přítomnosti laktózy indukována rychle
• 

zajistí transport laktózy do buňky

štěpí laktózu na glukózu a galaktózu

• proces zapnutí genové exprese látkou dodanou do prostředí, ve kterém buňka roste, se nazývá indukce
• geny, jejichž exprese je takto regulována, se nazývají inducibilní
• indukce nastává na úrovni transkripce a mění počet molekul příslušných proteinů (nikoliv aktivitu proteinů již existujících)
• typickými inducibilními enzymy jsou enzymy zapojené do katabolických (rozkladných) drah

• u prokaryot jsou geny s příbuznou funkcí často umístěny za sebou a jsou regulovány společně – tvoří operóny
• operón: soubor genů, které jsou společně přepisovány do jediné molekuly mRNA (polycistronové mRNA) a podléhají kontrole
• jediným regulátorem
• geny v operónu spolu funkčně souvisejí: např. kódují enzymy, které se účastní stejné biochemické dráhy
• u eukaryot se každý gen přepisuje samostatně
• 

• Transkripce operónu: polycistronová mRNA
• 

• Francois Jacob a Jacques Monod (1961)
• Nobelova cena za medicínu v roce 1965 (s André Lwoffem)

• tři strukturní geny: lacZ, lacY a lacA + regulační oblast proti směru transkripce
• lacZ kóduje ß-galaktozidázu (rozklad laktózy)
• lacY kóduje ß-galaktozidpermeázu (membránový protein, zajišťující transport laktózy do buňky)
• lacA kóduje ß-galaktozidacetylázu
• (přenos acetylové skupiny z acetylkoenzymu A na laktózu)
• lacI kóduje represor lac operónu (přepisuje se v opačném směru)

lac operón E. coli je regulační systém obsahující tři strukturní geny, které se účinně přepisují pouze za přítomnosti laktózy a nepřítomnosti glukózy

• ß-galaktozidáza je potřeba jen za přítomnosti laktózy a nedostatku glukózy 
• v opačném případě je transkripce lac operonu utlumena Lac represorem
• když se objeví laktóza, postačuje i malé množství rozkladných enzymů k jejímu rozštěpení na glukózu a galaktózu

• glukóza a galaktóza se spojují za vzniku alolaktózy, která inaktivuje Lac represor (induktor lac operónu)
• izomer laktózy
• 

vazebné místo pro represor LacI v promotoru lac operónu

za nepřítomnosti induktoru se LacI váže na operátor a blokuje vazbu RNA-polymerázy na promotor

za přítomnosti laktózy (vlastním induktorem je izomer laktózy – alolaktóza) dojde k uvolnění represoru (změna konformace, ztráta schopnosti vazby na DNA)

jiný mechanismus kontroly lac operónu, zprostředkován cAMP a pozitivním regulačním proteinem CRP („cAMP-receptor protein“), někdy rovněž zvaným CAP („catabolite-activator protein“)

cAMP se váže na CRP/CAP, čímž se mění jeho konformace do podoby umožňující pevnou vazbu na DNA v místě promotoru a díky interakci s RNA-polymerázou aktivuje transkripci lac operónu

adenylátcykláza a snižuje se produkce cAMP

CAP/CRP

CAP/CRP

glukóza brání indukci lac operónu  inaktivací adenylátcyklázy: bez cAMP se CRP/CAP inaktivuje, čímž se redukuje transkripce lac operónu

• 
• 

cAMP

glukózy (glukóza brání aktivaci adenylátcyklázy, tj. enzymu, který katalyzuje tvorbu cAMP)

• Za přítomnosti glukózy
• 1. adenylátcykláza je inaktivní
• 2. hladina cAMP je nízká
• 3. CAP/CRP se nemůže vázat na lac operón
• 4. strukturní geny lac operónu se neexprimují

• Za nepřítomnosti glukózy
• 1. adenylátcykláza je aktivní
• 2. hladina cAMP je vysoká
• 3. CAP/cAMP se váže na lac operón
• 4. strukturní geny lac operónu se exprimují

• je negativně regulován hladinou svého produktu, tj. AK tryptofanu (přidání trp do růstového média zastaví jeho biosyntézu)
• tryptofan aktivuje represor trpR
• represor trp se váže na několik operátorů
• nejdůležitější je operátor trpEDCBA řídící tvorbu enzymů, kterými se syntetizuje tryptofan
• mechanismus represe je ve všech případech založen na zabránění iniciace transkripce operónu

• trp operón využívá represoru pro zastavení transkripce genů pro biosyntézu tryptofanu

inaktivní

• dvě molekuly tryptofanu se vážou k dimeru trp represoru a změní jeho konformaci do stavu, kdy je schopen aktivní vazby na operátor
• vazba represoru znemožní vazbu RNA-polymerázy k promotoru a iniciaci transkripce

váže na lac operátor a brání RNA-polymeráze v iniciaci transkripce operónu