04a TRANSKRIPCE DNA a sestrih

• ^{popisuje cestu přenosu informace mezi biopolymery. V principu dovoluje přepis mezi nukleovými kyselinami a překlad z RNA do proteinů. To má za důsledek nemožnost toku informací z bílkovin do nukleových kyselin, a tedy zanášení změn v organismu zpět do genetické informace – tím je mj. popřen základní předpoklad teorie lamarckismu (dle níž se získané vlastnosti a dovednosti dědí).}
• 
• Samotný pojem „centrální dogma“ zavedl laureát Nobelovy ceny Francis Crick, avšak šlo o chybné pochopení toho, co slovo dogma znamená. Domníval se, že slovo dogma znamená něco zjevného, a nikoliv něco, co nelze zpochybnit.

• 1. REPLIKACE DNA (DNA dependentní DNA polymeráza)
• 2. TRANSKRIPCE (DNA depedentní RNA polymeráza) + možná zpětná transkripce
• 3. TRANSLACE
• translace + transkripce = proteosyntéza

• ↦fenotyp je výsledkem funkce enzymů, tj. proteinů
• ↦proteiny jsou syntetizovány podle zadáni genetické informace, transkripci a translaci
• ↦každá porucha tohoto toku informace se může projevit defektem v tvorbě proteinu a fenotypovou změnou

• = převedení informace v podobě sekvence deoxyribonukleotidů v DNA do sekvence ribonukleotidů v RNA (transkriptu)
• ↦ informace si v RNA udržuje podobnou chemickou povahu jako v DNA
• ↦ jedno z vláken dvoušroubovice DNA se použije jako templát pro syntézu komplementárního vlákna RNA
• ↦ kóduje-li transkript protein, podrobí se translaci v ribozomech, tj. informace se ze sekvence ribonukleotidů převede do pořadí AK v proteinech

• provozní („housekeeping“) geny se exprimují trvale
• x většina genů se exprimuje jen, když je potřeba

• ↦ primární transkript je ekvivalentní molekule mRNA (žádné introny, exony)
• ↦ mRNA se podrobuje translaci v ribozomech, které jsou díky absenci jaderné membrány snadno dostupné, tj. transkripce i translace jsou blízké fyzicky i časově - translace v těsném sousedství s transkripcí
• ↦ geny jsou často ve shlucích, řízeny jedním promotorem

• Specialita genů eukaryot
• introny: nekodujici sekvence
• exony: exprimovane sekvence
• ^{objeveny v roce 1977 v důsledku rozvoje sekvenčních technik}
• sekvence zahrnující introny i exony se přepisují do pre-mRNA
• neódující sekvence se následně vyštěpují sestřihovými úpravami ("splicing") ve speciálních makromolekularnich komplexech zvaných spliceozomy
• 

• transkripce a translace jsou prostorově i časově odděleny
• v jadře vzniká primární transkript (premRNA) obsahující přepisy exonů i intronů
• pre-mRNA se na obou koncích modifikuje a zbavuje přepisů intronů
• po úpravách se mRNA exportuje do cytoplazmy, kde se podrobí translaci

• jaderná membrána odděluje prostor pro transkripci a sestřih (jádro) od prostoru translace (cytoplazmy)
• existuje několik typů RNA, většinou se uplatňují mimo jádro, nutný export jadernými póry

mediátorová RNA (mRNA)—přenáší genetickou informaci z DNA do ribozomů

transférová RNA (tRNA)—adapter spojující AK a kodony v mRNA

ribozomová RNA (rRNA)—strukturní a katalytická složka ribozomů

malé jaderné RNA (snRNA)—strukturní složky spliceozomů, učast na sestřihu pre-mRNA

micro RNA (miRNA)—krátké jednořetězcové RNA, které blokují translaci komplementárních mRNA

small interfering RNA (siRNA)—krátké dvouřetězcové RNA, které selektivně rozkládaji komplementární mRNA a tak znemožňuji jejich translaci

další nekódující RNA (různé funkce, např. složka telomerázy)

• ↣ jednořetězcová molekula
• skladá se do specifického tvaru (párováním bází uvnitř téže molekuly) podobně jako polypeptidový řetězec proteinu
• ↣ je méně stabilní než DNA (atom kyslíku v ribóze zvyšuje jejií reaktivitu)
• 

• 1. začíná rozvolněním malé oblasti dvoušroubovice DNA- obnažení několika bází obou řetězců
• 2. jeden z řetězců DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárního vlákna (RNA)
• 3. výběr začleňovaného nukleotidu vyplývá z principu párování komplementárních bází
• 4. nový nukleotid je do rostoucího vlákna začleněn kovalentní vazbou
• 5. vzniklá RNA je přesnou komplementární verzí templátového řetězce
• 6. syntéza RNA probíhá ve směru 5’_3’

• 1. prekurzory jsou ribonukleozidtrifosfáty a ne deoxyribonukleozidtrifosfáty
• 2. přepisuje se jen jedno vlákno DNA
• 3. syntéza RNA iniciována de novo
• 4. vzniklý řetězec RNA nezůstává připojen vodíkovými vazbami k DNA, ale odvíjí se od něj, čímž umožňuje obnoveni struktury DNA
• 5. transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce
• 6. velikost transkriptů je podstatně menší než velikost genomů
• 7. transkripci zajišťuje DNA-dependentní RNA-polymeráza, zatímco replikaci katalyzuje DNA-dependentní DNA-polymeráza

• 1. odlišná chemická povaha substrátů a produktů reakce
• 2. RNA-polymerázy mohou katalyzovat tvorbu RNA za nepřítomnosti primeru
• 3. RNA-polymerázy jsou méně přesné než DNA-polymerázy

určují signální sekvence (promotory)

• katalyzují tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy a vytvářejí tak lineární řetězec
• pohybují se podél DNA, postupně rozvíjejí dvoušroubovici, obnažují templátový řetězec pro párováni s komplementárními bázemi

• ^{RNA-polymerazy jsou složite vicepodjednotkove proteiny, ktere katalyzuji syntezu vlakna RNA komplementárního templatovemu vlaknu DNA}
• ^{kovalentni prodlužovani řetězců RNA probiha uvnitř oblasti lokalniho rozvinuti DNA}
• ^{elongace konči v mistech, kde RNA-polymeraza zaznamena signal pro terminaci transkripce}

5´-3´

nukleozidtrifosfáty ATP, CTP, UTP a GTP

hydrolýza makroergických vazeb

• iniciace:
• rozeznání promotoru RNA-polymerázou, vazba na DNA, rozvinutí dvoušroubovice v místě startu transkripce, zahájení syntezy RNA

• elongace:
• pokračování v syntéze transkriptu podle informace v DNA-templátu

• terminace:
• ukončení synteéy transkriptu, uvolnění RNA polymerázy z templátu

• charakteristické rysy transkripce:
• 1. RNA-polymeráza se váže na specifickou nukleotidovou sekvenci DNA, tzv. promotor
• 2. první bázi transkriptu není první báze kódující sekvence - součástí transkriptu je krátká 5´-nekódující oblast
• 3. RNA transkript je komplementární templátovému vláknu a má analogickou sekvenci jako kódující vlákno

• vzniklá RNA se rychle uvolňuje z templátu
• transkripce téhož genu může být zahájena ještě před dokončením transkripce předchozí
• stejný gen může byt podroben často opakované transkripci
• RNA-polymeráza se pohybuje rychlostí 20 nukleotidů za sekundu (u eukaryot), resp. 40 nukleotidů za sekundu (u prokaryot)
• za hodinu se může vytvořit vice než 1000 transkriptů téhož genu

• úsek DNA, který začíná prvním a končí posledním přepisovaným nukleotidem
• může a nemusí být ekvivalentní genu (u prokaryot běžně zahrnuje několik genů)

• oblasti transkriptu RNA, které jsou umístěny směrem k 5´-konci (upstream, minus)
• nebo 3´-konci (downstream, plus) vzhledem k určitému referenčnímu bodu
• termíny se používají i pro ekvivalentní sekvence DNA
• místo iniciace transkripce se značí +1

• = vícepodjednotkový proteinový komplex (5 polypeptidů, z toho dva jsou identické) – kompletní enzym = tzv. holoenzym
• ↣ jádro enzymu obsahuje podjednotky α2, beta, beta´
• ↣ podjednotky α napomáhají sestavení jádra RNA-polymerázy
• ↣ podjednotka beta obsahuje vazebné místo pro rinobukleozidtrifosfáty
• ↣ podjednotka beta´obsahuje vazebné místo pro templátovou DNA
• ↣ podjednotka σ (sigma faktor) se učástní iniciace transkripce (po dokončeni iniciace a zahájení elongace se z komplexu uvolňuje) - zajišťuje specifickou vazbu RNA-polymerázy na promotor

• 1. k jádru enzymu se připojuje sigma faktor a vzniká tak holoenzym RNA-polymerázy
• 2. tento komplex klouže po molekule DNA
• pokud při pohybu po DNA narazí na promotor, naváže se na něj pevněji
• 3. promotor představuje startovní bod transkripce
• 4. za rozeznání promotoru zodpovídá sigma faktor RNA-polymerázy, který vytváří specifické kontakty s bázemi promotoru

• 3 kroky:
• 1. vazba holoenzymu RNA-polymerázy do promotorové oblasti DNA v dvojřetězcové konformaci (vzniká uzavřený komplex)
• 2. lokální rozvinutí vláken DNA, obnažení bází templátu v promotoru (včetně místa startu transkripce), aby se mohly párovat s volnými ribonukleotidy (vzniká otevřený komplex)
• 3. RNA-polymeráza katalyzuje tvorbu fosfodiesterovych vazeb mezi několika prvními nukleotidy vznikajícího vlákna RNA
• po spojení cca 10 prvních nukleotidů se oslabuje vazba mezi RNA-polymerázou a promotorem a mezi jádrem enzymu a sigma faktorem, iniciace konči, začíná elongace
• 

• = 1.krok iniciace
• vazba holoenzymu RNA-polymerázy do promotorové oblasti DNA v dvojřetězcové konformaci (vzniká uzavřený komplex)

lokální rozvinutí vláken DNA, obnažení bází templátu v promotoru (včetně místa startu transkripce), aby se mohly párovat s volnými ribonukleotidy (vzniká otevřený komplex)

• ^{RNA-polymeráza katalyzuje tvorbu fosfodiesterovych vazeb mezi několika prvními nukleotidy vznikajícího vlákna RNA}
• po spojení cca 10 prvních nukleotidů se oslabuje vazba mezi RNA-polymerázou a promotorem a mezi jádrem enzymu a sigma faktorem, iniciace konči, začíná elongace

• = krátké konzervativní sekvence vzdálené 35 a 10 nukleotidů proti směru transkripce od místa startu pro vazbu sigma faktoru
• ^{sekvence -35}: TTGACA
• ^{sekvence -10}: TATAAT (Pribnowův box, bohaté zastoupeni AT, místo prvotního rozvíjení dvoušroubovice)
• 

• katalyzována RNA-polymerázou po uvolnění σ faktoru
• prodlužování RNA tvorbou kovalentních vazeb mezi ribonukleotidy
• RNA-polymeráza se pohybuje po templátu a postupně rozvíjí DNA
• za polymerázou se obnovuje dvoušroubovice DNA, tím se vytěsňuje vznikající vlákno RNA
• ^{oblast přechodného párování mezi DNA a RNA je velmi krátká (cca 3 páry bází)}
• ^rychlost: 40 ribonukleotidů za sekundu

• 

• elongace transkripce pokračuje, dokud enzym nezaznamená ve struktuře DNA terminační signál (terminátor)
• v místě terminátoru se pohyb RNA-polymerázy zastaví, přeruší se vodíkové vazby mezi DNA a RNA a transkripční komplex se rozpadá
• dojde k uvolnění řetězce RNA
• uvolněna RNA-polymeráza může znovu asociovat se sigma faktorem a opět zahájit transkripci

• terminátory závislé na r (Rho) - vyžadují spoluúčast proteinu
• terminátory nezávislé na Rho - fungují za nepřítomnosti proteinu Rho a nevyžadují ani žádné další proteiny

• protein Rho se váže k syntetizované RNA ve specifickém místě umístěném proti proudu transkripce od terminátoru a pohybuje se po ni ve směru 5´- 3´
• jakmile se pohyb RNA-polymerázy na terminátoru zpomalí, protein Rho ji dostihne a zajistí uvolnění vlákna RNA

• obsahují sekvence bohaté na GC, po kterých následuje šest nebo více párů AT
• po přepisu do RNA v důsledku intramolekulárního párování bází GC vzniká vlásenka
• tato vlásenka zpomaluje pohyb RNA-polymerázy, což vede k terminaci transkripce v přilehlé oblasti AU a uvolnění transkriptu