-
každá buňka potřebuje svou úplnou sadu genů: rodičovská buňka musí svůj genom před dělením...
jaký je v tomto ohledu rozdíl mezi jedno a vícebun.organismy?
- duplikovat
- geny jsou umístěny v DNA chromozomů- každý chromozom je třeba přesně zkopírovat a kopie rozdělit do dceřiných buněk
- jednobuněčné organismy: buněčné dělení = reprodukce
- buněčné dělení = vznik nových buněk bez přímého spojení s rozmnožováním organismu
- mnohobuněčné organismy: reprodukce = vznik nových organismů,
-
stručně popiš princip Replikace DNA
- mechanismus duplikace DNA před buněčným dělením
- Princip:
- 1) vlákna v duplexech DNA jsou komplementární- po oddělení může každé z nich sloužit jako předloha - templát pro syntézu vlákna nového
- 2) nová vlákna vznikají postupným začleňováním nukleotidů na základě pravidel o párování bází
- 3) na konci replikace je každé vlákno templátu spárováno s nově syntetizovaným vláknem
- 4) replikace DNA je katalyzována enzymy
-
jaký je časový vztah replikace DNA k dělení buňky?
- proces musí proběhnout jen jednou v průběhu buněčného cyklu
- Dva hlavní principy:
- o následném buněčném dělení se rozhoduje v okamžiku iniciace replikace
- buněčné dělení nemůže nastat dokud není replikace dokončena
-
jaké jsou 3 Základní rysy replikace DNA?
- 1) DNA se replikuje semikonzervativně
- 2) iniciace replikace DNA nastává ve specifických místech - počátcích replikace ("origins")
- 3) z místa počátku replikace DNA probíhá oběma směry
-
co znamená že Replikace DNA je semikonzervativní ?
- každé vlákno rodičovské šroubovice zůstává zachováno
- oba řetězce původní dvoušroubovice fungují jako templáty
- výsledkem je dvoušroubovice obsahující jeden původní a jeden nově syntetizovaný řetězec
- původní řetězce zůstávají intaktní po mnoho generací
-
vyjmenuj historické Modely replikace DNA
- Semikonzervativní: každé vlákno rodičovské dvoušroubovice se zachovává a uplatňuje se jako templát
- Konzervativní: rodičovská dvoušroubovice se zachovává a řídí syntézu nové dvoušroubovice
- Disperzní: segmenty každého rodičovského vlákna se zachovávají a řídí syntézu segmentů nových komplementárních vláken, které se následně spojují
-
kdo prokázal, že platí semikonzervativní model navržený Watsonem a Crickem ?
- Matthew Meselson a Franklin Stahl (1958)
- důkaz byl založen na studiu hustoty DNA po označení těžkým dusíkem 15 N
- Důkaz semikonzervativního modelu replikace
-
-
kde začíná Replikace DNA?
- v počátku replikace - "origin"
- specifická nukleotidová sekvence (ori)
-
co je to replikon?
- úsek DNA, jehož replikaci zajišťuje vždy jeden počátek - ori
- u bakterií a virů je obvykle 1 počátek na chromozom (prokaryotické chromozomy obsahují jediný replikon)
- u velkých chromozomů eukaryot je mnoho počátků replikace (mnoho replikonů)
-
co je Replikační bublina a vidlice?
- po rozvolnění DNA v místě ori působením helikáz se templátové řetězce oddělují a vzniká replikační bublina
- od tohoto místa replikace probíhá v obou směrech a vzniká struktura tvaru "Y" zvaná replikační vidlice
-
jak je velký genom e.coli?
velikost 245 pb
-
co je to replizom?
- rozvolněná DNA a proteinový aparát v replikační vidlici
-
popiš Počátek replikace E. coli (oriC)
- přítomen v genomu 1x
- obsahuje 2 typy opakujících se sekvencí:
- - sekvenci 13 pb (opakovaná 3x, bohatá na AT, místo rozvolnění)
- - sekvenci 9 pb (opakovaná 4x, místo vazby proteinů, které jsou nezbytné pro tvorbu replikační bubliny)
-
funkční složky počátků replikace vyšších eukaryot dosud nejsou přesně známy velikost místa ori u vyšších eukaryot dosahuje až jakého počtu bází?
několika tisíc pb
-
popiš Počátky replikace u kvasinek
- v genomu v mnoha kopiích
- u kvasinek označované ARS (autonomně se replikující segmenty)
- - délka cca 50 pb
- - obsahují stěžejní sekvenci bohatou na AT o velikosti 11 pb
- AT je snadnější denaturovat,ptž jsou spojeny jedn dvěma vodíkovými můstky
-
kdy,kde a jak dochází k tvorbě RNA-primeru?
- po rozvinutí DNA v místě ori DNA-helikázou syntetizuje speciální RNA-polymeráza (primáza) krátké RNA-primery – komplementární k odděleným templátům
- RNA-primery se prodlužují DNA-polymerázou
-
pnutí v utahované šroubovici během replikace se uvolňuje ...
DNA-topoizomerázou
-
podmínkou replikace je dostupnost....
nespárovaných nukleotidů v řetězci DNA
-
pomocí kterých replikačních proteinů dochází k otvírání dvojšroubovice?
- dvoušroubovice je stabilní (pro denaturaci je potřeba teplota blízká teplotě varu)
- otevírání dvoušroubovice napomáhají 2 typy replikačních proteinů
- - DNA-helikázy: rozpétá vlákno
- - proteiny vážoucí jednořetězcovou DNA (SSB): zamezují opětovnému secvaknutí řetězců k sobě, "cuckování"
- - DNA-topoizomerázy: uvolňují pnutí (viz analogie s rozplétáním provázku
- + pro tvorbu RNA primerů nutné RNA-polymerázy
- +DNA-primázová aktivita syntetizuje RNA-primery
-
popiš molekuli a fci DNA-helikáz
- enzymy tvořící šestipodjednotkové válce, které obklopují jednořetězcovou DNA
- vážou a hydrolyzují ATP a díky tomu se po jednořetězcové DNA pohybují
- když narazí na oblast dvouřetězcové DNA, pokračují ve svém pohybu, přičemž odtlačují řetězce dvoušroubovice od sebe, báze tak ztrácí své partnery
-
hydrolýza: rozkladná rce, při které se spotřebovává voda
-
charakterizuj SSB proteiny
- Proteiny vážoucí jednořetězcovou DNA
- pevně se vážou na jednořetězcové úseky DNA vzniklé působením helikáz, aniž by blokovaly báze, které tak zůstávají k dispozici pro párování
- stabilizují vzniklé jednořetězce
- brání náhodnému intramolekulárnímu párování (tvorbě vlásenek), které by komplikovaly replikaci DNA
- na DNA se vážou kooperativním způsobem (vazba 1 monomeru stimuluje vazbu druhého)
-
fce DNA-topoizomerázy, jaké dva typy znáš?
- katalyzují tvorbu přechodných zářezů v DNA buď v jednom (topoizomeráza I) nebo obou vláknech (topoizomeráza II = DNA-gyráza)
-
-
- DNA se před replikační vidličkou otáčí díky rozvíjení šroubovice
- bez přerušení vláken DNA-topoizomerázami by rozvíjení DNA vedlo k tvorbě pozitivních nadšroubovicových závitů
-
-
jak funguje DNA-topoizomeráza I
- katalyzuje přechodné zářezy v jednom vlákně DNA:
- 1. kovalentní připojení enzymu k jednomu z fosfátů v DNA - dojde k přerušení fosfodiesterové vazby ⇒
- 2. DNA se může otočit kolem své osy
- 3. obnovení dvoušroubovice (opětovným vytvořením fosfodiesterové vazby)
odstraňuje nadšroubovicové vinutí (superspirilizace) z DNA
-
pro rozvinutí vláken v templátu v E.coli se musí šroubovice DNA před replikační vidlicí otáčet rychlostí...
3000rpm
-
jak funguje DNA-topoizomeráza II (DNA-gyráza) ?
- katalyzuje přechodné zářezy v obou vláknech
-
jaký je rozdíl mezi DNA a RNA polymerázami?
- Iniciace replikace: RNA-primery
- DNA-polymerázy
- ⇾nesyntetizují DNA de novo
- pouze prodlužují již existující řetězec se správně spárovaným nukleotidem disponujícím volnou 3´-OH skupinou
- nemohou tvořit DNA "z ničeho", ale potřebují primer, který prodlužují
- ⇾jsou velmi přesné
- RNA-polymerázy
- ⇾méně přesné, chyby jsou více tolerovány
- nedisponují exonukleázovou korektorskou funkcí
- ⇾mohou začít tvorbu nových polynukleotidových řetězců bez primeru
- jako primery při replikaci DNA proto slouží krátké úseky RNA
-
jakou reakci přesně katalyzují DNA-polymerázy?
- zajišťují vazbu deoxyribonukleotidu definovaného templátem k 3´-OH skupině primerového řetězce
- katalyzují tvorbu kovalentních (fosfodiesterových) vazeb mezi nukleotidy
-
jaké jsou Substrátové požadavky pro replikaci DNA katalyzované DNA-polymerázou?
- 1. primerové vlákno s volnou 3'-OH skupinou
- 2. templátové vlákno DNA určující sekvenci nového vlákna
- 3. volné dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
- 4. Mg2+
-
polymerace nově tvořeného řetězce probíhá jen ve směru ...
- 5´- 3´
- ⇒vedoucí řetězec je 3´- 5´
-
potřebná energie pro replikaci je zajištěna...
uvolněním pyrofosfátu z dNTP
-
DNA-polymeráza I: kdo ji objevil, kde je a popiš na jakém principu funguje
- První DNA-polymeráza, kterou se podařilo izolovat (Arthur Kornberg, 1957; Nobelova cena 1959)
- Zdroj: E. coli
- Mechanismus působení:
- kovalentní prodlužování řetězce DNA/RNA (primeru) ve směru 5´→ 3´
- po odštěpení pyrofosfátu dojde k vytvoření kovalentní vazby mezi posledním nukleotidem primeru a přicházejícím dNTP
- DNA-polymeráza I má dvě nukleázové aktivity:
- 5´→ 3´ exonukleázovou aktivitu: štěpí DNA od 5´-konců (ve formě krátkých oligonukleotidů)
- 3´→ 5´exonukleázovou aktivitu: odštěpuje mononukleotidy od 3´-konců DNA
-
jaký je rozdíl mezi exo a endonukleázou?
- Nukleáza je enzym, který degraduje nukleové kyseliny:
- exonukleáza štěpí nukleové kyseliny od konců
- endonukleáza štěpí DNA uvnitř molekuly
-
jakou fci má Exonukleázová aktivita 5´- 3´ DNA-polymerázy ?
- zajišťuje odstraňování RNA-primerů
-
jakou fci má Exonukleázová aktivita 3´- 5´ DNA-polymerázy?
zajišťuje korektorskou funkci DNA-polymerázy na nově syntetizovaném vlákně (čili ještě předtím, než se chyba zafixuje)
-
vyjmenuj nukleázové aktivity DNA polymeráz:
- 1. Exonukleázová aktivita 5´- 3´ DNA-polymerázy
- 2. Exonukleázová aktivita 3´- 5´ DNA-polymerázy
- 3. Polymerázová aktivita 5´-3´ DNA-polymerázy
-
Přehled DNA-polymeráz u E. coli
- 5 DNA-polymeráz
- replikaci DNA zajišťují DNA-polymeráza I (odstraňuje RNA primery, podíl na reparaci DNA) a DNA-polymeráza III (vlastní replikáza)
- na reparaci DNA se podílejí DNA-polymerázy I, II, IV a V
- rychlost replikace: cca 30 000 nukleotidů za minutu
-
Přehled DNA-polymeráz u eukaryot
- 15 DNA-polymeráz
- replikaci jaderné DNA zajišťují DNA-polymerázy α, δ, ε
- replikaci mitochondriální DNA zajišťuje DNA-polymeráza γ
- reparaci DNA zajišťují DNA-polymerázy β, ε, κ, ζ, µ, a η
- rychlost replikace: cca 3 000 nukleotidů za minutu
všechny tyto enzymy syntetizují DNA ve směru 5'- 3' (prodlužují 3´-konce) a požadují volnou 3'-OH skupinu na konci primeru
-
popiš DNA-polymerázu III
- je pravou replikázou DNA u E. coli
- vícepodjednotkový enzym
- minimální jádro s enzymovou aktivitou in vitro obsahuje podjednotky α, ε, θ
- podjednotka τ zajišťuje dimerizaci katalytického jádra
- podjednotka β tvoří dimer, který brání předčasnému uvolnění DNA-polymerázy z templátu
-
vysvětli význam Korektorské funkce
- =kontrola přesnosti replikace
- přesnost kopírování je překvapivě vysoká: pouze 1 chyba na 10 9 kopírovaných nukleotidů
- pokud by DNA-polymeráza neměla korektorskou funkci, byly by do nových řetězců DNA často včleňovány chybné nukleotidy a docházelo by k hromadění mutací
- korektorská funkce spočívá v kontrole konce právě syntetizovaného vlákna DNA, hledání chyb a jejich opravě
- Korektorská funkce DNA-polymerázy
- na 3´-konci primerového vlákna se objevuje chybný (nepárující se) nukleotid
- replikace se pozastaví
- exonukleázovou aktivitou 3´- 5´DNA-polymerázy se chybný nukleotid z řetězce uvolní
- DNA-polymeráza obnoví replikaci
-
Jak může DNA růst ve směru 3´- 5´?
- syntetizuje se ve směru 5´- 3´přerušovaně: nejprve se tvoří krátké tzv. Okazakiho fragmenty (dlouhé 1000-2000 nukleotidů u prokaryot, 100-200 nukleotidů u eukaryot)
- Okazakiho fragmenty se následně spojí do jednoho řetězce
- proto se rozlišuje vedoucí řetězec syntetizovaný průběžně a opožďující se řetězec, syntetizovaný přerušovaně
-
co víš o objevení okazakiho fragmentů?
- Objevitelé: Reiji Okazaki (1930-1975) a jeho manželka Tsuneko Okazaki (*1933)
- Nagoya University, Japonsko
- Reiji zemřel předčasně na leukémii na následek těžkého ozáření po bombardování Hiroshimi
- Tsuneko – první žena – profesorka v Nagoya University
-
jak probíhá Syntéza RNA-primerů při replikaci DNA?
- syntézu RNA-primerů zajišťuje komplex DNA-primázy a DNA-helikázy (tzv. primozom)
- primozom se pohybuje po molekule DNA poháněn energií ATP
- 1. DNA-helikázová aktivita uvolňuje jednořetězce rodičovské dvoušroubovice
- 2. DNA-primázová aktivita syntetizuje RNA-primery
- DNA-primáza (DNA-dependentní RNA-polymeráza) dokáže spojit dva ribonukleozidtrifosfáty na templátu DNA a dinukleotid prodloužit do krátkého polyribonukleotidu (10-60 nukleotidů u prokaryot, cca 10 nukleotidů u eukaryot) ve směru 5´-3´a vytvořit tak substrát pro DNA-polymerázu
-
kolik RNA-primerů je třeba při replikaci DNA?
- Vedoucí řetězec:
- postačuje jeden RNA-primer ⇾ replikace DNA probíhá bez přerušení
- Opožďující se vlákno:
- po dokončení syntézy každého Okazakiho fragmentu se syntetizuje další RNA-primer
-
jak dojde ke Spojení Okazakiho fragmentů?
- DNA-polymeráza prodlužuje RNA-primer a tvoří nové vlákno DNA
- syntéza Okazakiho fragmentu na opožďujícím se řetězci DNA skončí, jakmile DNA-polymeráza narazí na RNA- primer předchozího fragmentu
- při vytvoření celistvé struktury DNA na templátu opožďujícího se řetězce se uplatňují opravné mechanismy: RNA- primery odstraní a nahradí je DNA
- kovalentní spojení 3´-konce jednoho fragmentu DNA s 5´-koncem jiného zajistí DNA-ligáza
-
jak dojde k Odstranění RNA-primerů?
- RNA-primery jsou odstraněny 5´-3´-exonukleázovou a nahrazeny polymerační aktivitou DNA-polymerázy I
- 3´-OH konec jednoho Okazakiho fragmentu se spojí s 5´P koncem sousedního Okazakiho fragmentu DNA- ligázou
-
Funkce DNA-ligázy
- DNA-ligáza opravuje "zářezy" v cukrfosfátové kostře DNA, tj. porušené fosfodiesterové vazby
- DNA-ligáza se aktivuje vazbou s ATP a přechodně se připojí k volnému 5´P v místě zářezu (P-P se uvolňuje)
- uvolněním AMP se obnoví kovalentní vazba v řetězci
-
-
shrň průběh replikace DNA v E. coli
- 1. DNA-topoizomerázy vytvářejí v DNA přechodné zářezy, aby se DNA nesmotávala
- 2. proteiny vážoucí jednořetězce (SSB) pokrývají rozvinutou DNA
- 3. RNA-primery jsou nahrazovány DNA působením DNA-polymerázy I
- 4. jednořetězcové zářezy jsou odstraňovány DNA-ligázou
-
kdo objevil DNA polymerázy I a III?
-
jak funguje Replikace DNA otáčející se kružnicí?
- používaná viry pro duplikaci svých genomů
- bakteriemi pro přenos DNA z donora do recipienta
- Princip
- mechanismus replikace kružnicových molekulu DNA - jedno rodičovské vlákno zůstává intaktní a otáčí se a zároveň slouží jako templát pro syntézu nového komplementárního vlákna
- iniciace:
- 1. sekvenčně specifická endonukleáza štěpí jedno vlákno DNA v místě ori
- 2. neporušené templátové vlákno se otáčí kolem své osy a zároveň vytěsňuje 5´-konec druhého vlákna
- 3. kovalentní prodlužování nastává od 3´-OH konce naštěpeného vlákna (není třeba RNA primer)
- replikace DNA je úplná při otáčce templátu o 360 o
terminace nastává ve specifických místech Ter, kde se zastavuje pohyb helikázy
-
při Replikaci DNA otáčející se kružnicí mohou vznikat DNA dvou typů:
- - jednořetězcová kružnicová (po štěpení lineární DNA v oblasti ori a následné cirkularizaci)
- - dvouřetězcová kružnicová (ssDNA se použije pro syntézu dsDNA přes Okazakiho fragmenty, naštěpí se na jednotkovou délku a cirkularizuje se)
-
v čem se liší Replikace eukaryotických chromozomů od prokaryot?
- základní principy platné stejně jako u prokaryot
- Odlišnosti od prokaryot:
- 1. přítomnost mnoha počátků replikace (ori) - řádově 10 000
- 2. syntéza DNA probíhá jen v určité fázi buněčného cyklu (S-fázi)
- 3. RNA-primery a Okazakiho fragmenty jsou kratší
- 4. více typů DNA –polymeráz
-
popiš Složky eukaryotického replizomu
- 1. rozvíjení šroubovice vyžaduje aktivitu DNA-helikázy a DNAtopoizomerázy
- 2. PCNA zvyšuje procesivitu enzymu (=svorka, zv. svírací protein, upevnuje DNA polymerázu k řetězci)
- 3. rozvinuté řetězce se obklopují proteinem vážoucím jednořetězce - replikačním proteinem A (SSB)
- 4. replikace se účastní 3 různé DNA-polymerázy: Pol α, Pol δ a Pol ε
-
Korektorská funkce eukaryotických DNA-polymeráz
- DNA polymerázy δ a ε mají vysokou procesivitu, jsou vhodné pro syntézu dlouhých vláken; mají 3´ -5´exonukleázovou aktivitu pro korektorskou funkci, ale nemají 5´-3´ exonukleázovou aktivitu pro odstranění RNA primerů
- primery syntetizuje DNA-primáza a prodlužuje je
- Pol α Pol α udržuje stabilní komplex s DNA-primázou, napojuje na primery krátké řetězce DNA (cca 30 bp) při syntéze Okazakiho fragmentů
- RNA-primery odstraňují samostatné enzymy: ribonukleázy H1 a FEN1
- mezery po primerech zaplňuje Pol δ
- další prodlužování zajišťuje Pol δ
- zářezy odstraňuje DNA-ligáza
-
Duplikace nukleozomů v replikačních vidlicích
- EM: nukleozomy si udržují svou strukturu i vzájemnou vzdálenost na obou stranách replikační vidlice
- nukleozomy se rozkládají a zase rychle skládají, aby umožnily duplikaci DNA
- histony se syntetizují preferenčně během S-fáze
-
popiš Účast specifických proteinů na Rozkladu a sestavení nukleozomů během replikace DNA
- Nap-1 (nucleosome assembly factor 1): zajišťuje přenos histonů z místa jejich syntézy v cytoplazmě do jádra
- CAF-1 (chromatin assembly factor 1): zajišťuje přenos histonů do správných míst na chromozomech, kde mají vytvořit nukleozomy, váže se na PCNA
-
který enzym replikuje konce chromozomů /telomery?
- DNA-polymerázy nedokážou replikovat poslední segment opožďujícího se vlákna DNA lineárního chromozomu
- přidání koncových úseků (telomer) zajišťuje speciální mechanizmus, který je založen na aktivitě enzymu telomerázy
-
jaká je fce Telomeráz?
- zabraňuje zkracování konců chromozomů během každého replikačního cyklu
- disponuje aktivitou zpětné transkriptázy (TERT)
- obsahuje RNA, která slouží jako templát pro zpětnou transkripci
- váže se na 3´-přečnívající konec a prodlužuje jej přidáním několika telomerových sekvencí
-
jaký je vztah mezi délkou telomer a stárnutím?
- většina somatických buněk nemá telomerázovou aktivitu (na rozdíl od buněk kmenových nebo nádorových) - telomery se postupně zkracují
- lidské somatické buňky pěstované v kultuře projdou jen omezeným počtem dělení (50 - 70 generací) - pak nastane stárnutí a smrt
- koreluje délka telomer a počet buněčných dělení, které předcházejí stárnutí a smrti
- vzácně se stane, že somatické buňky začnou v kultuře neomezeně proliferovat (= růst a dělit se): na rozdíl od svých předchůdců mají telomerázovou aktivitu
- obdobně se chovají nádorové buňky
-
co je to progerie?
- dědičná onemocnění typická předčasným stárnutím (např. Hutchinson-Gilfordův syndrom, Wernerův syndrom )
- příznaky - předčasná plešatost, vrásčitost, apod.) se objevují krátce po narození
- smrt nastává před 20. rokem věku (HGS) nebo před 40. rokem věku (WS)
- v obou případech jsou v somatických buňkách zkráceny telomery a tyto buňky mají v kultuře sníženou proliferační schopnost
-
které enzymy katalyzují syntézu DNA?
- DNA-polymerázy
- všechny DNA-polymerázy požadují primerové vlákno (které se prodlužuje) a templátové vlákno (které se kopíruje)
- všechny DNA-polymerázy striktně požadují volnou 3'-OH skupinu na primerovém vlákně a syntéza veškeré DNA probíhá výhradně ve směru 5' → 3'
-
které aktivity DNA- polymeráz mají korektorskou funkci?
- 3' → 5' exonukleázové aktivity DNA- polymeráz
- kontrolují vznikající vlákna a odstraňují chybně spárované nukleotidy na 3' -koncích primerových vláken
-
replikaci konců lineární DNA zajišťuje ...
telomeráza
|
|