03 Elektroforeza

Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějím separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů

• Princip
• –Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli
• –Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny

• Cíl
• –Dělení molekul na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí

• Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny
• –agarózou
• –polyakrylamidem
• Vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry
• Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru
• Optimální velikost separovaných molekul
• –agarózové gely 100 bp až 50 000 bp
• –polyakrylamidové 10 až 1000 bp

• ^{Agaróza je polysacharid tvořený střídajícími se galaktózovými a 3,6-anhydro-galaktózovými podjednotkami. Je teoreticky zcela nenabitá, nicméně může obsahovat příměsi nabitých sulfátových či pyruvátových skupin. Našla celou řadu praktických uplatnění v laboratorní praxi, vytváří síťovitý materiál, v němž může být realizována elektroforéza, imunodifuze, gelová filtrace či afinitní chromatografie.}
• ^{Agaróza je (spolu s agaropektinem) součástí surového materiálu, tzv. agaru, který se získává z mořských řas}

• Složení: kopolymer akrylamidu a N,N,- metylenbisakrylamidu
• Monomer je neurotoxin a mutagen
• Katalyzátor – tetramethylethylendiamin (TEMED)
• Iniciátor – persíran amonný (NH4)2S2O8
• Radikálová polymerace
• V důsledku přítomnosti bifunkčního agens N,N,- metylenbisakrylamidu řetězce kroslinkují a vytvářejí gel

• Nanášecí pufry slouží při elektroforéze NA
• –Zvýšení hustoty vzorku - to umožní, že DNA klesne na dno jamky
• –Obarvení vzorku pro snadnější nanášení
• –Přidání pohyblivého barviva do vzorku pro možnost sledování průběhu elektroforézy

• –Založené na sacharóze
• –Založené na glycerolu
• –Kombinované

• Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti.
• Velikost fragmentu DNA o neznámé velikosti lze proto stanovit srovnáním jeho elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí fragmentů o známé velikosti, označovaných jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy.
• Těmi bývají většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním, např, fága lambda.

• Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné.
• Molekuly DNA lze snadno zviditelnit

• –Přímým barvením vhodným barvivem
• Nejjednodušší a nejlevnější
• Barvivo se váže na DNA
• Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů
• ^–Příklad: Spolehlivě detekovatelné množství DNA v proužku na gelu je 1-2 ng. Aby byl detekován fragment o velikosti 200 bp pocházející ze sekvence dlouhé 20 kb, musí být do jamky na gel naneseno 200 ng DNA.
• –Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA
• Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence
• Každý fragment má stejný počet konců, intenzita značky není závislá na délce fragmentu
• Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky
• Je citlivější než barvící metody, ovšem dražší

–Hybridizací se značenou sondou

SYBR® Green a SYBR® Gold

• vysoká afinita k NA
• 1000× vyšší fluorescence po vazbě na NA
• 25 – 100 × citlivější než EtBr
• Vhodná pro ds DNA, ssDNA a RNA
• 60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm)
• mnohem méně mutagenní než EtBr

• Barvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr
• Citlivost 100 pg DNA v PA
• dsDNA, ssDNA i RNA
• Lepší citlivost vykazuje u polyakrylamidových gelů než u agarózových
• Barvení zahrnuje 3 kroky:
• –Fixace (metanol, ledová kyselina octová a glycerol)
• –Barvení (uhličitan sodný, dusičnan amonný, dusičnan stříbrný a kyselina wolframovokřemičitá)
• –Zastavení (ledová kyselina octová)

• –254 nm
• –302 nm
• –365 nm