02 Enzymy

• ROZDĚLENÍ
• Podle typu substrátu
• - DNA enzymy
• - RNA enzymy
• Podle typu reakce
• - enzymy syntetizující NK (anabolické) = polymerázy
• - enzymy odbourávající NK (katabolické) = nukleázy
• - enzymy modifikující NK
• - enzymy spojující molekuly NK = ligázy

• Působení enzymů používaných při manipulaci s DNA:

• součást restrikčně modifikačních systémů bakterií
• omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech (např. fág namnožený v E.coli kmeni C nemůže účinně infikovat E.coli kmen K – degradace fágové DNA)
• DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací
• původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem

•  ^{enzym, který štěpí DNA (tzn. nukleáza), a to na určitých specifických místech (tzv. restrikčních místech) na řetězci DNA. Navíc umožňují methylaci DNA.}
• Tyto enzymy jsou známy zejména u bakterií, jimž slouží jako ochrana před bakteriálními viry nebo nežádoucími plazmidy.
• Endonukleázy se hojně využívají v biologickém výzkumu (např. metoda RFLP).
• Kolem roku 2005 bylo známo již přes 2 500 restrikčních endonukleáz, které umožňovaly stříhat DNA na asi 250 místech.
• Restrikční endonukleázy se rozdělují do tří skupin (I., II., III.) a mají poměrně specifické názvosloví, sestávající z názvu organizmu, z něhož pochází, a z charakteristické zkratky.

• nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA
• prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu
• základ pro genové inženýrství

• štěpí dvouřetězcové molekuly DNA ve specifických místech
• většina RE rozeznává palindromy (obrácené repetice)
• štěpí oba řetězce DNA
• rozdělují se do tříd I, II, III a IV

• vážou se na specifické (4-6 pb) sekvence nukleotidů
• katalyzují štěpení dvou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství
• k štěpení dochází vždy ve stejném místě
• štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA
• rozeznávací sekvence mají téměř vždy charakter obrácených opakování: stejná sekvence je štěpena ve stejném místě v obou řetězcích
• molekulová hmotnost: 20.000 - 100.000

• tupé konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě)
• ostré konce (po štěpení řetězců v různých místech, která jsou obvykle vzdálena 1-4 nukleotidy)
•   - 5´přečnívající
•   - 3´přečnívající

• např. EcoRI
• 1. písmeno: počáteční písmeno jména rodu produkční bakterie
• 2. a 3. písmeno: první dvě písmena jména druhu bakterie
• označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy)
• římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z téže bakterie

množství RE, které kompletně rozštěpí 1mg  DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí

velikostí

• enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho řetězce a 3´OH skupinou druhého řetězce za spotřeby ATP nebo NAD
• fyziologický význam při replikaci, rekombinaci a reparaci DNA
• analogické RNA ligázy katalyzují in vitro podobné reakce při ligaci ssRNA

• příprava rekombinantních molekul DNA
• možno spojovat fragmenty DNA různého původu (restrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.)

• T4-DNA-ligáza
• izolace z buněk E.coli infikovaných fágem T4
• spojuje lepivé i tupé konce DNA
• opravuje jednořetězcové zlomy („nicks“) v dvouřetězcové DNAm RNA a u hybridů DNA/RNA
• vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5´konci a OH skupiny na 3´konci molekuly

• Bakteriální DNA ligáza
• izolace z E. coli
• spojuje jen DNA s lepivými konci

• syntetizují NK postupným doplňováním nukleotidů k 3´OH konci stávající molekuly nukleové kyseliny
• není známá žádná polymeráza prodlužující 5´konec DNA
• matricí (templátem) je jednořetězcová DNA nebo RNA
• polymerázy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce

• ^{zdroj - E.coli}
• katalyzuje 3 různé reakce:
• 1.Polymerázová aktivita: Prodlužování polynukleotidového řetězce ve směru 5´- 3´
• –matrice je čtena ve směru 3´- 5´
• –tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3´OH skupiny rostoucího řetězce a 5´P dNTP za tvorby pyrofosfátu
• –požadavek přítomnosti primeru

• 2. Exonukleázová aktivita 5´- 3´i 3´- 5´
• –hydrolýza řetězce DNA v obou směrech

• 3. Degradace DNA ve směru 5´-3´a současná syntéza degradovaného řetězce
• –oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo („proof-reading“)
• –využití při značení DNA („nick translace)
• –exonukleázové aktivity mohou záviset na přítomnosti iontů Mg2+ nebo Mn2+

• ^{jeden ze dvou produktů proteolytického štěpení DNA polymerázy I subtilizinempolymerázová aktivita 5´- 3´exonukleázová aktivita 3´- 5´}
• Využití:
• při značení DNA („fill-in“ 3´zkrácených konců a pomocí „random hexamers“)
• sekvenování DNA Sangerovou metodou
• syntéza druhého řetězce cDNA

• katalyzuje přidání deoxynukleotidů k 3´OH konci molekul DNA
• substrátem jsou přečnívající, zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA nebo ssDNA
• nevyžaduje matrici ani primer
• zdroj: telecí brzlík
• využití: přidání homopolymerních konců k 3´koncům DNA
• značení 3´konců DNA

• možnost připojení dlouhých úseků komplementárních nukleotidů na 3´koncích vektoru a insertu
• velikost připojených úseků nemusí být stejná (pokud se jedná o úseky větší než 20 nukleotidů, jejich párování je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě)
• v transformovaných buňkách se nespárované oblasti opraví reparačními mechanismy

• =Připojení homopolymerních konců ke klonované DNA terminální transferázou

• RNA-dependentní DNA polymeráza
• přepis genetické informace z RNA do DNA
• požadována přítomnost primeru a matrice
• poskytuje v první fázi hybrid RNA/DNA, po odstranění rna působením hydroxidů nebo RNázy H lze zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA
• syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA polymeráza I

• Aktivity:
• polymerázová
• 5´- 3´exoribonukleázová
• 3´- 5´exoribonukleázová (RNázaH)

• zdroj: retroviry
• M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus)
• AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
• RSV (Rous Sarcoma Virus)

• Využití:
• tvorba cDNA
• - specifická (primer oligo dT)
• - nespecifická (primer komplementární k   3´oblasti hledané mRNA)

• Syntéza cDNA

• Nukleáza S1 = endonukleáza specifická pro jednořetězcovou DNA
• Zdroj:  bakterie Aspergillus oryzae
• Využití:
• odstraňuje jednovláknové struktury z DNA (odstranění nespárovaných smyček)
• hydrolýza jednořetězcových konců

• Mapování nukleázou S1

• nespecifická deoxyribonukleáza
• substrátem je dvouřetězcová i jednořetězcová DNA
• za přítomnosti kofaktoru Mg2+ jsou místa štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích
• za přítomnosti kofaktoru Mn2+ jsou přednostně štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě
• Zdroj: hovězí pankreas
• Využití:
• nízké koncentrace: vytváření jednořetězcových zlomů v ds DNA
• vyšší koncentrace: odbourání DNA z roztoků RNA

• Ribonukleáza A
• nespecifická ribonukleáza
• Zdroj: hovězí pankreas
• Využití:
• odbourání RNA z roztoků DNA

• Ribonukleáza H
• sekvenčně specifická ribonukleáza, rozpoznávající hybridní molekuly RNA:DNA