02 struktura DNA, RNA

• DNA obsahuje genetickou informaci a tak tvoří hmotnou podstatu genů
• gen je nukleotidová sekvence, která je nezbytná pro syntézu funkčního genového produktu (polypeptidu nebo RNA) – nejde jen o kódující sekvenci, zahrnuje i promotory, sestřihová místa, apod.

• 

na chromozomech

nukleovou kyselinou (DNA) a proteiny

^{ve 40. a 50 . letech 20. stol. bylo jednoznačně prokázáno, že genetická informace je uložena v nukleových kyselinách a ne proteinech}

mendel, morgan

geny neopouštějí buňky a tím jsou nepřístupné chemické analýze

• =horizontální přenosu genů
• Frederick Griffith (anglický bakteriolog) ve 20. letech 20. století začal zkoumat bakterii Streptococcus pneumoniae (pneumokok)

transformace je běžná u bakterií (nikoliv u savců)

• Frederick Griffith (anglický bakteriolog) ve 20. letech 20. století začal zkoumat bakterii Streptococcus pneumoniae (pneumokok)
•  -- návaznost na obrovskou epidemii španělské chřipky v r. 1918, která byla často doprovázena zápalem plic vyvolaným touto bakterií  - Ministerstvo zdravotnictví zadalo průzkum pneumokoka a usilovalo o vytvoření vakcíny Fr

Frederick Griffith (1928):  existují 2 příbuzné kmeny Streptococcus pneumoniae, které se liší morfologicky a stupněm patogenicity: kmen R: tvoří drsné kolonie a není letální kmen S: tvoří hladké kolonie, po injekci usmrcuje laboratorní myši

• Griffithův experiment
• 1)virulentní hladké bakterie injikoval myším- smrt
• 2)virulentní hladké bakterie zabil teplem a pak provedl injekci - přežívají
• 3)injekce směsí zabitých virulentních bakterií s živými nevirulentními - smrt!
• 4)pitva usmrceným myší - obsahují buňky virulentních bakterií  - neškodné bakterie R se nějak „transformovaly“ na virulentní S
• existuje chemická látka schopná přenášet dědičné instrukce mezi organismy – „genová molekula“

^{zdrženlivý Griffith otálí s publikací tohoto revolučního závěru, až v lednu 1928 na nátlak přátel svůj experiment publikuje v neznámém časopise Journal of Hygiene, článek psán v omluvném stylu za otřes, který genetice způsobuje}

• Streptococcus pneumoniae:
• Kmen S: buňky obklopeny cukerným pláštěm, který usnadňuje únik imunitnímu systému, proto vysoká virulence  - HLADKÉ KOLONIE
• Kmen R: buňky postrádají cukerný plášť, jsou méně nebezpečné - DRSNÉ KOLONIE
• 

• Oswald Avery & Colin MacLeod & Maclyn McCarty (40. léta 20. století)
• za transformaci bakterií Streptococcus pneumoniae zodpovídá DNA
• přidání purifikované DNA k bakteriím mění jejich vlastnosti (tvar kolonií, schopnost vyvolat onemocnění, apod.)
• získané vlastnosti se přenášejí do následných generací

• založen na transformaci bakterií R různými frakcemi inaktivovaných bakterií S
• transformační schopnost si uchovává pouze DNA

• 1) oddělení RNA a proteinů u dvou kmenů TMV ^{(=virus tabákové mozaiky)} (A a B, lišících se chemických složením proteinových obalů)
• 2) vytvoření virových částic smísením RNA (A) s proteinem (B)
• 3) vznikl životaschopný virus, jehož potomstvo mělo fenotyp A
• 4) po smísení RNA (B) s proteinem (A) vznikl virus s fenotypem B
• závěr: potomstvo virů je genotypově a fenotypově shodné s rodičovským virem, ze kterého pochází RNA

• nukleotidů
• 1) pětiuhlíkový cukr 
• 2) dusíkovou bázi
• 3) zbytek kyseliny fosforečné

• ribóza u ribonukleových kyselin
• deoxyribóza u deoxyribonukleové kyseliny
• odlišnost je v přítomnosti/nepřítomnosti hydroxylové skupiny na 2´-uhlíku

• 

připojují se na uhlík 1 cukru kovalentní N-glykozidickou vazbou

• 
• jsou dvou typů:
• pyrimidinové (cytozin, tymin, uracil)
• purinové (adenin, guanin)
• 

připojen k uhlíku 5 cukru esterovou vazbou přináší nukleotidu negativní náboj

cukry

kovalentními fosfodiesterovými

pravidelné střídání motivu cukr-fosfát-cukrfosfát...

• 
• 

• 1 konec obsahuje fosfát (5´-konec),
• druhý obsahuje hydroxylovou skupinu (3´-konec)

• DNA je obvykle dvouvláknová molekula, ve které jsou obě vlákna spojena vodíkovými vazbami mezi dvojicemi bází adenin - tymin a gunanin – cytozin
• RNA je obvykle jednovláknová a obsahuje místo tyminu uracil

• 

• 1953: James Watson a Francis Crick odvodili strukturu DNA na základě těchto údajů:
• chemická data: Erwin Chargaff koncentrace tyminu je v organizmech stejná jako koncentrace adeninu a koncentrace cytozinu je vždy stejná jako koncentrace guaninu
• fyzikální data: Maurice Wilkins a Rosalind Franklinová po vystavení purifikovaných molekul DNA rentgenovému záření, dochází k charakteristickému rozptylu paprsků, které signalizují způsob uspořádání složek DNA do šroubovice

• ^{Maurice Wilkins}
• ^{vystudoval fyziku na Cambridge}
• ^{po přečtení Schrödingerovy knihy „Co je život“ se stává nadšencem „nové biologie“}
• ^{v r. 1946 se stává zástupcem vedoucího oddělení biofyziky na Kings College v Londýně}
• ^cíl: objasnění trojrozměrné struktury DNA
• ^metoda: krystalografie a rentgenová difrakce

•  ^{Rosalind Franklinová}
• ^{specialistka na krystalografii}
• ^{přijata na oddělení biofyziky Kings College v lednu 1951, aby pracovala na struktuře DNA}
• ^{Wilkins očekává, že se k němu připojí jako mladší asistentka, to ale Franklinová neměla v úmyslu}
• ^{vztah Wilkinse s Franklinovou}: „nenávist na první pohled“
• ^{Franklinová je nesmírně šikovná a pracovitá, změnou vlhkosti v inkubátorech dosahuje podstatného zkvalitnění difrakčních obrazů DNA}

•  ^{James Watson}
• ^{vystudoval ornitologii na University of Chicago}
• ^{vyhýbá se fyzikálním a chemickým kurzům}
• ^{rovněž jej silně ovlivňuje Schrödinger svou knihou „Co je život“}
• ^{pracuje na chemii nukleových kyselin v Kodani}
• ^{na jaře 1951 si vyslechne přednášku Maurice Wilkinse v Neapoli}
• ^{na konci přednášky Wilkins promítá rozmazaný obrázek rozptylu rentgenových paprsků na DNA}
• ^{Watsona silně zaujme, po návratu do Kodaně požádá o přeložení do laboratoře Maxe Perutze v Cambridge, zde se setkává s Francisem Crickem}

•  ^{Francis Crick}
• ^{vystudovaný fyzik, velmi inteligentní, extrovert}
• ^{ve 40. letech přechází k biologii, dobře rozumí matematickým aspektům krystalografie}
• ^{DNA ho přitahuje díky své schopnosti přenášet informaci}
• ^{spolu s Watsonem tvoří dvojici pohrdající autoritami, v dlouhých diskusích se projevuje neuctivost, bláznovství a genialita}
• ^{uznávají jen Linuse Paulinga, který se v USA věnuje studiu proteinů a v roce 1951 publikuje jejich alfa-šroubovicovou strukturu}
• ^{Crick rozpoznává, že proteinovou šroubovici Pauling odhalil spíše na základě své představivosti než složitých matematických vzorců}
• ^{při hledání struktury DNA s Watsonem volí podobnou cestu – modelování}

• ^{Modelování DNA}
• ^{bylo známo, že řetězec DNA se skládá z páteře tvořené cukry a fosfáty a čtyř připojených bází A, T, G, C}
• ^{nebylo jasné, jak jsou tyto složky vzájemně uspořádány a provázány, co je vně, co je uvnitř}
• ^{první model}: tři řetězce obtočené do šroubovice, cukr-fosfátová kostra uvnitř, báze směřující ven
• ^{volají Wilkinsovi a Franklinové, aby se přišli podívat}
• ^Wilkins: model je „neuspokojivý“
• ^Franklinová: je to nesmysl, především negativně nabité fosfáty nemohou směřovat dovnitř – kvůli odpuzování by se taková molekula rychle rozpadla
• ^{v lednu 1953 Watson navštěvuje Wilkinse}
• ^{Wilkins Watsonovi sděluje, že Franklinová nasnímala nové fotografie rentgenové difrakce DNA vynikající kvality}
• ^{tu nejlepší z nich Wilkins Watsonovi ukazuje bez vědomí Franklinové}
• ^{je z ní na první pohled jasné, že DNA má tvar šroubovice}
• ^{druhý den ráno začíná Watson s Crickem nové modelování DNA}
• ^{zkoušejí variantu, že kostra je umístěna vně a báze směřují dovnitř}
• ^{ukazuje se, že v omezeném prostoru uvnitř šroubovice mezi bázemi musí být nějaký vztah, aby se tam vešly}
• ^{vztah mezi bázemi naznačoval Erwin Chargaff již v r. 1950}: v DNA hladiny A/T, resp. G/C vždy odpovídají, jako by se vázaly
• ^{důležité jsou rozměry šroubovice, které Watsonovi a Crickovi ale nebyly známé}
• ^{opět poslouží data Franklinové získaná bez jejího vědomí}
• ^{Watsonovi a Crickovi je poskytuje jejich nadřízený Max Perutz (ten se k datům dostal jako člen evaluačního výboru ze zprávy o činnosti Wilkinse a Franklinové)}
• ^{2. 1953 Watson testuje umístění nestejných bází proti sobě a zjištuje, že tvarově dokonale „sedí“}
• ^{navíc logický souhlas s Chargaffovými pravidly}
• ^{vznik modelu dvoušroubovicové DNA}

• za fyziologických podmínek pravotočivá dvoušroubovice (B-forma)
• protilehlé řetězce jsou vázány vodíkovými vazbami mezi bázemi
• báze orientovány dovnitř dvoušroubovice, cukr-fosfátová kostra je na její vnější straně
• větší purinová báze se páruje s menší pyrimidinovou šroubovici stabilizují vazby nad sebou umístěných aromatických kruhů

• báze se uvnitř dvoušroubovice orientují do energeticky nejvýhodnějšího uspořádání
• jedna otáčka šroubovice připadá na 10 párů bází, průměr 1,9 nm
• vinutí vytváří v šroubovici velký a malý žlábek
• obě vlákna dvoušroubovice jsou antiparalelní a plně komplementární

• adenin se spojuje s tyminem dvěma vodíkovými vazbami
• guanin s cytosinem třemi vodíkovými vazbami

B-DNA: ve vodných roztocích a běžných koncentracích solí

A-DNA: rovněž pravotočivá, s 11 pb na otáčku, objevuje se u dehydratovaných vzorků

Z-DNA: levotočivá, s 12 pb na otáčku, výskyt u dvojšroubovic bohatých na páry GC, funkce v živých systémech nejasná

genetickou informaci

sekvence nukleotidů druhého řetězce = základ dědičnosti genetické informace

pořadí nukleotidů jejich DNA

lineární pořadí aminokyselin a trojrozměrnou strukturu proteinů

trojrozměrná struktura proteinů zodpovídá za jejich funkci

vodíkové vazby mezi vlákny dvoušroubovice jsou mnohem slabší než kovalentní vazby mezi nukleotidy uvnitř vláken: s pomocí určitých enzymů lze dosáhnout oddělení vláken a jejich kopírování do komplementárního vlákna (replikace DNA )

• chromozom je komplex dlouhé molekuly DNA a proteinů, které pomáhají udržovat jeho strukturu
• na chromozomu jsou v lineárním pořadí uspořádány geny oddělené regulačními a mezigenovými úseky

• kružnicové molekuly dvouřetězcové DNA
• nesou většinou 3000 – 4000 genů
• intergenové úseky jsou velmi krátké, úspornost genomu
• skupiny sousedních genů s minimálními mezigenovými úseky (operóny) mohou sdílet jednu regulační oblast
• při replikaci se v určitém místě dvoušroubovice rozvolňuje a replikuje se oběma směry

• komplex lineární molekuly dvouřetězcové DNA a proteinů
• obsahují centromeru a dvě koncové telomery
• nesou až 50 000 genů
• intergenové úseky jsou rozsáhlé
• eukaryota jsou obvykle diploidní: v každé buňce jsou chromozomové páry (u člověka 46 chromozomů, 23 párů, z toho jeden pár pohlavních chromozomů)
• ve světelném mikroskopu viditelné jen v době buněčného dělení
• karyotyp: úplná sada metafázových chromozomů v dané buňce/organismu – základ cytogenetických analýz

• ^{úplná sekvence známá např. u mnoha virů, bakterií, kvasinek, octomilky, háďátka, myši, člověka, atd.}
• nalezení dosud neznámých genů
• odhad počtu všech genů kódujících proteiny
• odhad funkcí nových genů
• srovnání mezi druhy – evoluční souvislosti

• ^{velká část genomu vyšších eukaryot nekóduje mRNA}
• ^{v nekódujících oblastech DNA jsou podobné, ale nikoliv identické oblasti}
• ^{vysoká variabilita některých repetitivních sekvencí (specifické pro každého jedince)}
• ^{dříve se nekódující oblasti považovaly za bezúčelnou „junk“ DNA}
• ^{dnes se jim přisuzuje evoluční význam}

• introny: nekódující sekvence
• exony: kódující sekvence
• evoluční tlak udržuje sekvence exonů u různých jedinců daného druhu ve stejné nebo velmi podobné struktuře 
• změny struktury intronů, včetně úplné ztráty, se tolerují: malý funkční význam
• funkce většiny sekvencí intronů není známa – patrně přispívají k variabilitě proteinových struktur (alternativní sestřih), umožňují vazbu regulátorů, podílejí se na regulaci genové exprese

• mitochondrie a chloroplasty
• obsahuje geny kódující proteiny související s funkcí těchto organel (ale ne všechny)
• součást genomu daného organismu

• 25-50% genů mnohobuněčných organismů kódujících proteiny jsou v haploidním genomu zastoupeny pouze 1x: solitérní geny
• např. gen kódující lysozym (enzym, který štěpí polysacharidy buněčné stěny bakterií, složka vaječného bílku, obsažen v slzách)

• geny s velmi podobnou, ale ne zcela identickou strukturou, které kódují příbuzné proteiny (proteinové rodiny)
• např. rodiny imunoglobulinů nebo kináz mají stovky členů

• rodina globinových genů kóduje proteiny podílející se na tvorbě hemoglobinu
• určité typy globinů se exprimují jen ve vyvíjejícím se plodu – vytvářejí hemoglobin s vyšší afinitou ke kyslíku než hemoglobin dospělých (snadněji získávají kyslík z krevního oběhu matky placentou)
• nižší afinita ke kyslíku je výhodnější u hemoglobinu dospělých organismů, protože usnadňuje jeho uvolnění v tkáních, především svalech, které mají při zátěži velkou spotřebu kyslíku

2 identické polypeptidy ß-globinu vytvářejí komplex se dvěma identickými polypeptidy α-globinu (členy jiné rodiny) + 4 hemové skupiny

• Vznik genových rodin: duplikace
• různé geny pro ß-globin vznikly duplikací původního genu
• během evoluce se v obou genech hromadily náhodné mutace
• mutace výhodné pro funkci přenosu kyslíku se fixovaly

• v oblasti ß-globinové rodiny se nacházejí pseudogeny
• pseudogeny se podobají původním genům (vznikly rovněž duplikací), ale jsou kvůli mutacím nefunkční pseudogeny nejsou škodlivé – pasivně se v genomu udržují

• toto uspořádání mají především geny kódující RNA (např. rRNA nebo RNA fungující při sestřihu), po kterých je v buňce vysoká poptávka
• kódují zcela nebo téměř identické produkty
• geny jsou umístěny v mnohonásobném opakování bezprostředně za sebou

úsek DNA, obsahující alespoň 100 kodónů, který začíná iniciačním a končí terminačním kodónem, o kterém není známo, zda má kódující funkci

• NENÍ
• ^{(C. elegans má více genů než octomilka, člověk nemá ani 2x více genů než C. elegans)}
• ze struktury genomu nelze biologickou komplexitu odvozovat přímo
• K variabilitě přispívají:
• alternativní sestřih
• posttranslační modifikace
• regulace genové exprese

• odlišnosti v počtu kopií opakujících se sekvencí využitelné pro profilování DNA (fingerprinting)  - používá se pro identifikaci zločinců od r. 1988
• pravděpodobnost shody profilů dvou osob je zanedbatelná 1:10 ⁹

• 
• 
• 

• tandemové repetice variabilního počtu (VNTR), minisatelity, opakující se sekvence 10-80 pb
• krátké tandemové repetice (STR), mikrosatelity, opakující se sekvence o délce 2-10 pb
• počet jejich kopií je vysoce variabilní a proto ideální pro profilování
• v určitých oblastech genomu je počet opakování VNTR a STR snadno detekovatelný (restrikční analýza, PCR, elektroforéza)