01 izolace NK

  1. jaké jsou požadavky na izolaci nukleových kyselin?
    • V nativním stavu z přirozeného materiálu
    • – v dostatečném množství  (lze si pomoci amplifikací)
    • – požadované čistotě.
    • Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám
    • – přečišťovací enzymy
  2. vychozím materiálem pro izolaci NK mohou být:
    • – Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek)
    •           Genomová
    •           Plazmidová
    • – Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány
    • – Virové částice purifikované centrifugačními technikami
    • – NK v elektroforetických gelech
    • – Produkty PCR reakcí
  3. Jaké metodické principy lze využít při izolace NK?
    • Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením = LYZE
    • Enzymů (lysozym a celulázy)
    • Detergentů (dodecylsulfát sodný)
    • - mechanicky (lyzační matrice, FastPrep)
    • Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant = PROČIŠTĚNÍ
    • – Proteináza K nebo pronáza E
    • – RNáza nebo DNáza (výsledkem krátké fragmenty)
    • Kroky využívající různou rozpustnost
    • – Fenolová extrakce
    • – Adsorpce na pevný podklad
    • Centrifugace
    • Precipitace
  4. k čemu slouží FastPrep Kity?
    • Izolace z neznámých a těžcezpracovatelných vzorků
    • –tkáně
    • – rostlinný materiál
    • – gram + bakterie
    • – sediment
    • – kosti
  5. jaké dva typy metod rozlišujeme při izolaci nukleových kyselin?
    • 1.Metody využívající rozdílné rozpustnosti
    • Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení)
    • Obecně rozšířené, široké aplikace
    • Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK
    • 2. Metody adsorpční
    • DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky
    • Vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů
  6. charakterizuj fenol
    • =organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK
    • sám o sobě kyselý, poškodil by DNA - musí se smíchat s pufrem, aby se dosáhlo požadovaného pH
    • nemísí se s vodou, má vysokou hustotu - sedá ke dnu
  7. na jakém principu fenol oddělí proteiny od NK?
    Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze
  8. proč se do roztoku sloužícího k oddělení NK a proteinů při typické fenolové extrakci přidává chloroform?
    Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku
  9. při typické fenolové extrakce promícháme které substance?
    Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu
  10. vyjmenuj metody využívající rozdílné rozpustnosti
    • fenolová extrakce
    • izolace plazmidové DNA
    • izolace RNA
  11. vyjmenuj jednotlivé kroky fenolové extrakce
    • promíchání lyzátu buněk s roztokem
    • centrifugace
    • vysrážení NK etanolem, příp.izopropanolem
    • shromáždění precipitátu NK a rozpuštění sedimentu
  12. čím jsou tvořeny vrstvy získané centrifugací během fenolové extrakce?
    Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny.
  13. Jaké látky napomáhají vysrážení NK po fázi centrifugace?
    • Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem.
    • Účinnému vysrážení nukleových kyselin přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí.
  14. vyjmenuj Základní složky roztoků zvyšujících stabilitu NK
    • NaCl – iontová síla
    • Tris hydrochlorid (TE)– pufrovací činidlo
    • EDTA (chelaton3)– chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz) - stabilita pH
  15. kde najdeme plazmidovou DNA?jak vypadá?
    • Výskyt u bakterií
    • Topologie molekuly
    • – Dvouřetězcová DNA
    • – Kružnicový tvar
    • – Malá velikost
    • – Více kopií v buňce
  16. popiš princip izolace plazmidové DNA
    • plazmid se snadno naštěpí, vložíme tam gen a sledujeme jeho expresi
    • na zač.stejný postup jako v případě celé DNA, ale jeden krok navíc-přidání pufru s NaOH(fce=zvýšení pH)
    • metody založené na denaturaci a renaturaci:
    • -alkalická lyze
    • způsobí že dojde k denaturaci = rozpad struktury vlivem vyššího pH - zisk jednotl.řetězců
    • -lyze varem
    • k renaturaci se používá např. k.octová, octan draselný - přidává se po alk.lyzy - vysrážení proteinů, kt. s sebou strhnou většinu DNA
  17. popiš jednotlivé kroky Alkalické lyze pro izolaci plazmidové DNA
    • Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika
    • Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym)
    • Přídavek roztoku s NaOH
    • Denaturace bakteriálního chromozomu
    • ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU
    • Přídavek neutralizačního roztoku
    • Vysrážení chromozomální DNA s proteiny
    • RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA
    • Odstranění bakteriální DNA centrifugací
    • Purifikace plazmidové DNA
  18. Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly:
    • – Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H2O, rukavice! třeba pracovat pečlivěji
    • – Extrakce v guanidinových solích
    • – Extrakce Trizolem
    • – Fenolové extrakce při pH 5-6
    • – Odstranění DNA DNázami bez RNáz
    • – Selektivní srážení RNA pomocí LiCl
    • – Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA
  19. na jakém principu fungují adsorpční metody?
    • =alternativa k org.extrakcím
    • Využívají schopnost NK adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli

    Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant

    Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O

    Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota

    • Image Upload 1
  20. jaké znáš chaotropní soli?
    • – guanidin thiokyanát
    • – guanidin hydrochlorid
    • – jodid sodný (NaI)
  21. síla vazby mezi NK a chaotropní soli závisí na:
    • – Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA)
    • – Iontové síle
    • – pH roztoku

    Image Upload 2
  22. jak se izoluje mRNA?
    • mRNA tvoří pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná
    • Pro izolaci se využívají
    • – Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, rRNA a tRNA
    • Metody využívající afinitu poly(A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy
    • Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA
    • Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem

    • Image Upload 3
    • Streptavidinem pokryté mikrozkumavky

    Image Upload 4

    • Streptavidinem pokryté magnetické částice
  23. k analýze a kvantifikaci NK slouží...
    SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA
  24. jaký je princip SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODy?
    • – Vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou :
    • o Dostatečné koncentraci
    • Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant.

    • – Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm.
    • Image Upload 5
Author
iren
ID
345591
Card Set
01 izolace NK
Description
molekularni biologie
Updated