01 izolace NK

• V nativním stavu z přirozeného materiálu
• – v dostatečném množství  (lze si pomoci amplifikací)
• – požadované čistotě.
• ^{Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám}
• – přečišťovací enzymy

• – Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek)
•           Genomová
•           Plazmidová
• – Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány
• – Virové částice purifikované centrifugačními technikami
• – NK v elektroforetických gelech
• – Produkty PCR reakcí

• Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením = LYZE
• – Enzymů (lysozym a celulázy)
• – Detergentů (dodecylsulfát sodný)
• - mechanicky (lyzační matrice, FastPrep)
• Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant = PROČIŠTĚNÍ
• – Proteináza K nebo pronáza E
• – RNáza nebo DNáza ^{(výsledkem krátké fragmenty)}
• Kroky využívající různou rozpustnost
• – Fenolová extrakce
• – Adsorpce na pevný podklad
• Centrifugace
• Precipitace

• Izolace z neznámých a těžcezpracovatelných vzorků
• –tkáně
• – rostlinný materiál
• – gram + bakterie
• – sediment
• – kosti

• 1.Metody využívající rozdílné rozpustnosti
• Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení)
• ^{Obecně rozšířené, široké aplikace}
• ^{Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK}
• 2. Metody adsorpční
• DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky
• ^{Vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů}

• =organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK
• ^{sám o sobě kyselý, poškodil by DNA - musí se smíchat s pufrem, aby se dosáhlo požadovaného pH}
• ^{nemísí se s vodou, má vysokou hustotu - sedá ke dnu}

Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze

Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku

Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu

• fenolová extrakce
• izolace plazmidové DNA
• izolace RNA

• promíchání lyzátu buněk s roztokem
• centrifugace
• vysrážení NK etanolem, příp.izopropanolem
• shromáždění precipitátu NK a rozpuštění sedimentu

Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny nukleové kyseliny.

• Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem.
• Účinnému vysrážení nukleových kyselin přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí.

• NaCl – iontová síla
• Tris hydrochlorid (TE)– pufrovací činidlo
• EDTA (chelaton3)– chelatační činidlo (ochrana před působením nukleáz) - stabilita pH

• Výskyt u bakterií
• Topologie molekuly
• – Dvouřetězcová DNA
• – Kružnicový tvar
• – Malá velikost
• – Více kopií v buňce

• plazmid se snadno naštěpí, vložíme tam gen a sledujeme jeho expresi
• ^{na zač.stejný postup jako v případě celé DNA, ale jeden krok navíc-přidání pufru s NaOH(fce=zvýšení pH)}
• metody založené na denaturaci a renaturaci:
• -alkalická lyze
• ^{způsobí že dojde k denaturaci = rozpad struktury vlivem vyššího pH - zisk jednotl.řetězců}
• -lyze varem
• ^{k renaturaci se používá např. k.octová, octan draselný - přidává se po alk.lyzy - vysrážení proteinů, kt. s sebou strhnou většinu DNA}

• Kultivace buněk v přítomnosti antibiotika
• Šetrné odstranění buněčné stěny (lysozym)
• Přídavek roztoku s NaOH
• Denaturace bakteriálního chromozomu
• ČÁSTEČNÁ DENATURACE PLAZMIDU
• Přídavek neutralizačního roztoku
• Vysrážení chromozomální DNA s proteiny
• RENATURACE PLAZMIDOVÉ DNA
• Odstranění bakteriální DNA centrifugací
• Purifikace plazmidové DNA

• – Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H2O, rukavice! ^{třeba pracovat pečlivěji}
• – Extrakce v guanidinových solích
• – Extrakce Trizolem
• – Fenolové extrakce při pH 5-6
• – Odstranění DNA DNázami bez RNáz
• – Selektivní srážení RNA pomocí LiCl
• – Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA

• =alternativa k org.extrakcím
• Využívají schopnost NK adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli

Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant

Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O

Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota

• – guanidin thiokyanát
• – guanidin hydrochlorid
• – jodid sodný (NaI)

• – Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA)
• – Iontové síle
• – pH roztoku

• ^{mRNA tvoří pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná}
• Pro izolaci se využívají
• – Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, rRNA a tRNA
• – Metody využívající afinitu poly(A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy
• ^{Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA}
• ^{Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem}

• Streptavidinem pokryté mikrozkumavky

• Streptavidinem pokryté magnetické částice

SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA

• ^{– Vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou :}
• ^{o Dostatečné koncentraci}
• ^{Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant.}

• – Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm.