Gentechnik V9

  1. Welche Schritte müssen bei der Isolierung einer Nukleinsäure aus Zellen (Bakterien, pflanzlichen und tierischen Zellen) durchgeführt werden?
    • Zellaufschluss: um an die RNA oder DNA in der Zelle bzw. im Zellkern zu gelangen, müssen zunächst die Zellwand (bei Bakterien und Pflanzenzellen) und/oder die Zellmembran (bei allen Zellen) und die Kernmembran (bei eukaryotischen Zellen) aufgelöst werden, und die RNA oder DNA ggf. aus Komplexen mit Proteinen (z.B. Histonproteine im Chromatin) „befreit“ werden
    • Isolierung der Nukleinsäure: die Nukleinsäure muss anschließend aus dem Zellextrakt = Gemisch von Lipiden, Proteinen, Zuckern , Salzen, usw., isoliert werden
    • Aufreinigung und Konzentrierung der Nukleinsäure: nachdem die Nukleinsäure isoliert wurde, müssen die restlichen Salze entfernt und die in der wässrigen Lösung vorliegende Nukleinsäure konzentriert werden
  2. Welche mechanischen Verfahren für den Zellaufschluss können angewendet werden, und welches sind die wesentlichen Merkmale dieser Verfahren?
    • Mörsern: wird bei Zellen mit einer dicken und stabilen Zellwand eingesetzt  Pflanzenzellen und Bakterien (Sporen)
    • Triturieren und Ultraschall: kommen meist bei tierischen Zellen zum Einsatz
  3. Welche chemischen Verfahren für den Zellaufschluss können angewendet werden, und welches sind die wesentlichen Schritte bzw. Merkmale dieser Verfahren?
    • Lyse: es werden Detergenzien (meist SDS) zur Auflösung der Lipidmembranen (Zellmembran und Organellen) und EDTA (Chelator, fängt zweiwertige Kationen wie Mg2+ ab, die z.B. Nukleasen benötigen, um aktiv zu sein) verwendet. Zum Aufbrechen der Bakterienzellwand muss Lysozym zugegeben werden, zum Verdauen großer Mengen Protein in manchen Zellen bzw. Geweben werden Proteasen (z.B. Proteinase K) verwendet
    • alkalische Lyse: für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen, ohne dass das bakterielle Ringchromosom mit isoliert wird. Die Bakterienzellen werden in einem EDTA (zur Chelation divalenter Kationen wie Mg2+  werden für die Aktivierung von z.B. Nukleasen benötigt) und RNase (zum Abbau der RNAs in der Zelle)-haltigen Puffer nach der Zentrifugation (Pelletierung) resuspendiert, und mit einem Detergens (SDS) in alkalischer (NaOH) Lösung versetzt  das Detergens löst die Lipide der Zellmembran auf, das NaOH denaturiert die Proteine und Nukleinsäuren (Doppelstränge lösen sich in Einzelstränge auf). Durch die Zugabe von saurer Kaliumacetat-Lösung wird der alkalische pH der vorherigen Behandlung neutralisiert, dabei renaturieren die Einzelstränge der Plasmid-DNA wieder zu einem Doppelstrang, nicht aber die Einzelstränge der chromosomalen DNA (diese sind dafür zu groß). Die Einzelstränge der chromosomalen DNA fallen (präzipitieren) zusammen mit dem SDS und den Proteinen in der Lösung aus
  4. Welche chemischen Verfahren für die Isolierung der Nukleinsäure aus dem Zellextrakt können angewendet werden, und welches sind die wesentlichen Schritte bzw. Merkmale dieser Verfahren?
    • Zwei-Phasen organische Extraktion: wird für die Isolierung einer Nukleinsäure aus einem Zellextrakt verwendet. Zu dem Zellextrakt wird eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform, oder eine 25:24:1 Mischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol zugegeben, ausgeschüttelt und zentrifugiert  es bilden sich 2 Phasen (organisch unten und wässrig oben) und eine Interphase. In der organischen Phase lösen sich die hydrophoben Lipide, in der Interphase befinden sich die amphiphilen Proteine, und in der wässrigen Phase lösen sich die hydrophilen Nukleinsäuren, Kohlehydrate, Salze, usw. Um eine reine Nukleinsäure zu erhalten, kann dieser Schritt wiederholt werden. Abschließend wird nur mit Chloroform extrahiert, um die Phenol-Reste zu entfernen.
    • Für die Isolierung von RNA muss bei der Extraktion darauf geachtet werden, dass saures Phenol (pH 5) und ein chaotropes Salz (Guanidiniumthiocyanat) verwendet werden  DNA löst sich dann in der Interphase und kann von der RNA getrennt werden
    • Anionenaustauschchromatographie: Ein positiv geladenes Harz, i.d.R. Silikagel = Kieselgel, in einem Träger = Säule bindet bei hohen Salzkonzentrationen und leicht saurem pH die negativ geladene Nukleinsäure. Lipide, Proteine, Kohlehydrate, Salze, usw. werden unter diesen Bedingungen und durch Zugabe eines Ethanol-haltigen Puffers aus der Säule gewaschen. Die Nukleinsäure wird bei niedrigen Salzkonzentrationen und leicht basischem pH von dem Träger (Harz) eluiert. Anwendung: „Kits“: je nach Menge der zu isolierenden DNA gibt es unterschiedliche Säulengrößen, und je nach Art der Nukleinsäure (DNA oder RNA) gibt es unterschiedliche Varianten des Isolationsprotokolls
  5. Welche physikalischen Verfahren für die Isolierung der Nukleinsäure aus dem Zellextrakt können angewendet werden, und welches sind die wesentlichen Schritte bzw. Merkmale dieser Verfahren?
    • Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation: das Zellextrakt wird mit einer Cäsiumchlorid (CsCl)-Lösung und Ethidiumbromid (EtBr) versetzt
    • in einer Ultrazentrifuge bei sehr hohen Geschwindigkeiten (ca. 200.000x g bzw. 50.000 rpm) über mind. 12 h zentrifugiert
    • das CsCl bildet einen Dichtegradienten, in dem dichtere Partikel (z.B. einzelsträngige, linearisierte oder „genickte“ DNA) weniger weit wandern wie weniger dichte Partikel (z.B. superhelikale DNA)
    • Die jeweiligen DNA-Typen bilden daher Banden an den entsprechenden Positionen im CsCl-Dichtegradienten, und können unter Bestrahlung mit UV-Licht isoliert werden
    • Der jeweilige DNA-Typ (z.B. PlasmidDNA) wird mit einer Spritze abgesaugt
    • durch Extraktion (Ausschütteln) mit Butanol von EtBr-Resten gereinigt
    • Die extrahierte Lösung wird dann über ≥ 12 h gegen destilliertes Wasser oder TE-Puffer dialysiert, um das CsCl-Salz zu entfernen
    • Für die Isolierung einer Nukleinsäure (meist DNA) aus einem Agarosegel z.B. nach einem Restriktionsverdau oder einer PCR wird die präparative Gelelektrophorese eingesetzt: Dazu wird das gewünschte Fragment mit einem Skalpell aus dem Agarosegel heraus geschnitten
    • in einen speziellen Bindepuffer überführt, der ein chaotropes Salz und einen pH-Indikator enthält
    • Unter leicht sauren Bedingungen wird das Gelstück-Puffer-Gemisch erhitzt
    • die Agarose löst sich auf und setzt die DNA frei
    • Die freigesetzte DNA kann dann über eines der zuvor beschriebenen Verfahren (meist aber durch Anionenaustauschchromatographie) aufgereinigt werden
  6. Welches Verfahren wird für die Aufreinigung und Konzentrierung der Nukleinsäure angewendet, und welches sind die wesentlichen Schritte bzw. Merkmale dieses Verfahrens?
    alkoholische Fällung (Präzipitation): In einer leicht sauren (pH 5,2) und weniger polaren (alkoholischen, z.B. Ethanol oder Isopropanol) Lösung wird die normalerweise negativ geladene Nukleinsäure als teilweise protonierte (H+ von der Säure), teilweise mit Salzionen (Na+, K+, Li+ aus zugegebenem NaAc, Kac, LiCl) gesättigte, ungeladene Form aufgrund der Verringerung ihrer Löslichkeit ausgefällt. Weil Salze und einige Zucker dabei mitgefällt werden, ist ein abschließender Waschschritt mit 70% Ethanol i.d.R. notwendig
Author
Bibi
ID
337833
Card Set
Gentechnik V9
Description
Gentechnik, letzte Vorlesung, 3. Semester
Updated