Gentechnik V8

  1. Welche eukaryotischen Zelllinien sind in der Gentechnik/Biotechnologie am gebräuchlichsten?
    • HEK-293 Zellen: human embryonic kidney, menschliche embryonale Nierenzellen, mit einem Adenovirus immortalisiert („unsterblich gemacht“) und deshalb besonders für die Produktion von Adenoviren und AAV geeignet
    • HEK-293T Zellen: human embryonic kidney SV40 Large TAntigen, eine Variante der HEK-293 Zellen, die mit einem SV40 Large T-Antigen Konstrukt transfiziert wurden und zur episomalen Replikation von Plasmiden mit einem SV40 origin of replication sowie zur Produktion von Retroviren und Lentiviren geeignet sind
    • CHO Zellen: chinese hamster ovary, mit einem SV40 Large TAntigen Konstrukt immortalisierte Zelllinie aus Ovarien des chinesischen Hamsters, wachsen in Suspensionskultur und produzieren große Mengen an Protein, weshalb sie vor allem in der Biotechnologie zur Produktion rekombinanter (eukaryotischer) Proteine eingesetzt werden
  2. Was zeichnet einen eukaryotischen Expressionsvektor (Plasmid) aus?
    • Plasmide, die neben den prokaryotischen = bakteriellen Komponenten: Replikationsursprung, Antibiotikaresistenz, ggf. lacZ‘-Gen
    • regulatorische Elemente der Eukaryoten besitzen: eukaryotischen Promotor (der durch die eukaryotische Transkriptionsmaschinerie erkannt wird) und ein Polyadenylierungssignal für die transkribierte mRNA, sowie Selektionsmarker für eukaryotische Zellen, wie z.B. ein NeomycinPhosphotransferasegen, das die Resistenz gegen den Proteinbiosynthesehemmer Geneticin G418 verleiht
  3. Was ist die Transfektion?
    Einführung von DNA in eukaryotische (tierische) Zellen mittels verschiedener chemischer oder physikalischer Methoden
  4. Welche chemischen Methoden gibt es zur Transfektion eukaryotischer Zellen?
    • Calciumphosphat-Präzipitation: die zu transfizierende DNA (in einem Phosphatpuffer gelöst) wird mit einer CaCl2-Lösung unter Luftzufuhr (Blubbern) versetzt  es bildet sich ein Calciumphosphat-Niederschlag (Präzipitat), an das sich die DNA anlagert. Dieses Präzipitat wird zu den Zellen gegeben, die es über Endocytose aufnehmen. Die endocytierte DNA wird freigesetzt und wandert während der Zellteilung (Mitose) in den Zellkern
    • Lipofektion: dabei wird die zu transfizierende, negativ geladene DNA in Lipidvesikeln = Liposomen verpackt. Die Liposomen/DNA-Komplexe werden über Endocytose von der Zelle aufgenommen. Nach der Endocytose fusionieren die Liposomen/DNA-Komplexe mit den Endosomen, die DNA wird in diesen wieder freigesetzt und wandert während der Zellteilung (Mitose) in den Zellkern
  5. Welche physikalischen (mechanischen) Methoden gibt es zur Transfektion eukaryotischer Zellen?
    • Elektroporation: durch einen kurzen aber starken (2000-2500 V) Strompuls werden die Zellmembran eukaryotischer Zellen bzw. Zellwand von Bakterienzellen vermutlich permeabilisiert, d.h. es entstehen kleine Poren, durch die polare Makromoleküle wie DNA in die Zelle eindringen können. Außerdem kann die negativ geladene DNA durch den Stromstoß von der Kathode zur Anode getrieben werden
    • Biolistik: mittels einer Genkanone = Genpistole (engl. gene gun) werden DNA-überzogene Mikropartikel aus Gold oder Wolfram in die Zellen „geschossen“. Dort löst sich die DNA von den Mikropartikeln ab und wandert in den Zellkern. Sie ist insbesondere für die Transfektion von pflanzlichen Zellen geeignet, die eine nur schwer zu durchdringende Zellwand besitzen, und die einzige Methode, um Organellen wie Mitochondrien und Chloroplasten zu transfizieren.
    • Mikroinjektion: dabei wird die zu transfizierende DNA mittels einer Mikrokapillare direkt in den Zellkern bzw. in das Zytoplasma der Zellen injiziert. Sie ist für die Transfektion schwer zu durchdringender Pflanzenzellen, zellwandlose Pflanzenzellen = rotoplasten und für die Herstellung transgener Tiere besonders geeignet
  6. Welche Vor- und Nachteile haben die mechanischen Methoden?
    • Elektroporation: es werden spezielle Geräte = Elektroporatoren und Küvetten benötigt. Außerdem müssen die Zellen sich in Suspension befinden, und die Zell- bzw. Bakteriensuspension muss komplett salzfrei sein, weil sonst die Gefahr eines Kurzschlusses besteht, bei dem alle Zellen absterben würden
    • Biolistik: es werden ebenfalls spezielle und teure Geräte (Genkanone) und Zubehör (Gold- oder Wolframpartikel) benötigt, sie ist deshalb mit hohen Beschaffungs- und Betriebskosten verbunden
    • Mikroinjektion: benötigt den größten materiellen Aufwand, weil u.a. ein hochwertiges Inversmikroskop, ein Mikroinjektor und ein Mikromanipulator benötigt werden
    • Vorteile: auch Pflanzenzellen, Organellen usw.
Author
Bibi
ID
337831
Card Set
Gentechnik V8
Description
Gentechnik, 8. Vorlesung, 3. Semester
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