Gentechnik V7

Übertragung von Fremd-DNA auf eine Bakterienzelle (z.B. E. coli) durch einen Bakteriophagen

• der rekombinante M13-Vektor (mit Anteilen eines Bakterien-Plasmids) wird zusammen mit einem F-Plasmid (→ Pilus, der für die M13- Transduktion notwendig ist) in E. coli transformiert
• auf die jeweiligen (auf den Plasmiden befindlichen) Antibiotikaresistenzen selektiert
• Die transformierten E. coli-Zellen werden dann mit einem replikations-defizienten M13 Helferphagen infiziert, der alle für die Verpackung der Phagenpartikel benötigten Proteine bereitstellt
• Die E. coli-Zellen beginnen nun mit der Produktion replikationsinkompetenter (da die Verpackungsproteine nicht mehr in der Phagen-DNA codiert werden) M13 Phagenpartikel, deren einzelsträngige DNA anschließend isoliert werden kann.

• zunächst werden replikations-inkompetente, rekombinante Phagen mit Hilfe eines replikations-defizienten λ-Phagen im Reagenzglas hergestellt
• E. coli-Zellen werden anschließend mit diesen rekombinanten, replikations-inkompetenten λ-Phagen transduziert (= infiziert)

• Plaques: bakterienfreie Flächen auf einem Bakterienrasen, weil diese durch den Phagen lysiert (abgetötet) wurden
• blau weiß bei M13

• Infektion durch Viren
• Retroviren: RNA-Viren!
• Adeno-assoziierte Viren: DNA-Viren!

Retroviren (zu denen auch Lentiviren gehören): behüllte Viren, die einzelsträngige RNA enthalten

• Die einzelsträngige RNA muss erst durch eine reverse Transkriptase in doppelsträngige DNA umgeschrieben werden, bevor sie sich in das Wirtsgenom integrieren kann
• Die Integration in das Wirtsgenom ist notwendig, um neue Virenpartikel zu produzieren

• Vorteile: relativ großen Genome (7-12 kb im dsDNA-Zustand), die die Klonierung größerer DNA-Fragmente zulassen
• Nachteile: sie integrieren an willkürlicher Stelle ins Wirtsgenom, was die Gefahr der Mutagenese (Mutationsentstehung) und vor allem Tumorbildung in den Wirtszellen stark erhöht; sehr immunogen = aktivieren das Immunsystem (u.a. aufgrund der Proteine in der Hülle)

• eigentlicher retroviraler Klonierungsvektor, der nur noch die LTRs (= long terminal repeats) enthält, wurde von den Vektoren getrennt, die die Hüllproteine (env) und Replikations- u.a. Proteine (gag, pol, usw.) nunmehr unter der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors exprimieren
•  die Hüll- u.a. Proteine können nur in eukaryotischen Zellen hergestellt werden und sind nicht mehr auf der viralen RNA codiert. Die Infektion von eukaryotischen Zellen mit einem Retrovirus verläuft deshalb immer in mehreren Schritten

• Werden die Vektoren = Plasmide mit dem eigentlichen Transgen, den env und den gag/pol/usw. Genen in E. coli transformiert  Gewinnung ausreichender Mengen an DNA.
• Die so gewonnene Plasmid-DNA wird in eukaryotische Zellen transfiziert = Verpackungszellen  Zellen produzieren rekombinante und replikationsinkompetente Retroviren.
• Die rekombinanten Virenpartikel werden durch Zentrifugation aus dem Zellkulturüberstand geerntet
• Die eigentlichen eukaryotischen Zielzellen werden mit den rekombinanten Retroviren infiziert

• HEK-293T-Zellen 
• kommerzielle Verpackungszellen, die die env und gag/pol/usw.-Gene stabil in ihr Genom integriert haben

Adeno-assoziierte Viren (AAV): unbehüllte Viren, die einzelsträngige DNA enthalten und einen Helfervirus (Adenovirus) für ihre Replikation benötigen

• Vorteile: In Abwesenheit eines Helfervirus können sie die Zielzelle nur infizieren, aber nicht in ihr replizieren, und ihre DNA integriert in das Wirtsgenom (Beim Menschen ist dies nur eine ganz bestimmte Integrationsstelle auf Chromosom 19) 
• In Anwesenheit eines Helfervirus replizieren sie und bilden Concatemere = aneinander gereihte Folgen des Virusgenoms, die episomal in der Zelle verbleiben  bei sich teilenden Zellen geht der Virus über die Zeit verloren, bei nicht-teilenden Zellen bleibt er erhalten.
• Sie sind aufgrund der fehlenden Hülle kaum immunogen
• Nachteil: sehr kleines Genom von max. 4,8 kb, Größe der klonierbaren DNA-Fragmente auf max. 4,7 kb begrenzt

• AAV-Klonierungsvektor enthält nur noch die ITRs (= inverted terminal repeats)
• von Vektoren getrennt, die die Capsid-Proteine (Cap), Replikations-Proteine (Rep) und den replikations-defizienten Helfervirus nunmehr unter der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors exprimieren
• die Capsid- u.a. Proteine können nur in eukaryotischen Zellen hergestellt werden und sind nicht mehr auf der viralen DNA codiert.

• die Vektoren = Plasmide mit dem eigentlichen Transgen, den Cap- und Rep-Genen und dem Helfervirus in E. coli transformiert  Gewinnung ausreichender Mengen an DNA
• Die so gewonnene Plasmid-DNA wird in eukaryotische Zellen transfiziert = Verpackungszellen
• Zellen produzieren rekombinante und replikations-inkompetente Retroviren
• Die rekombinanten Virenpartikel werden durch Zentrifugation aus dem Zellkulturüberstand geerntet.
• Die eigentlichen eukaryotischen Zielzellen werden mit den rekombinanten AAV-Viren infiziert.

• HEK-293
• HEK-293T Zellen

• Die maximale Größe der klonierten Fremd-DNA ist begrenzt: von 4,7 kb (AAV), 10 kb (Lentiviren) bis zu 20 kb (λ-Phagen)
• Die Wirtsspezifität der Viren: Proteine im Capsid bzw. in der Hülle legen fest, welche Zellen von dem Virus infiziert werden können = Serotyp des Virus

• Serotyp: Wirtsspezifität
• Pseudotypisierung: Indem verschiedene env- bzw. Cap-Plasmide mit dem Transgen und den restl. Plasmiden kombiniert werden, kann die Wirtsspezifität des Virus variiert werden