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Was ist der Unterschied zwischen horizontalem und vertikalem Gentransfer?
- horizontaler Gentransfer: Transfer von genetischem Material zwischen zwei verschiedenen Organismen (Pflanzen- oder Tierarten)
- vertikale Gentransfer: Übertragung von genetischem Material zwischen den Generationen (Vorfahren zu Nachkommen) i.d.R. am Ende eines gentechnischen Eingriffs erwünscht
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Was ist ein gentechnisch veränderter Organismus (GVO)?
- gentechnisch veränderter Organismus (GVO, engl. genetically modified organism, GMO)
- Organismus, dessen Erbgut durch das Hinzufügen artfremder Gene oder durch die Veränderung bzw. die Entfernung arteigener Gene gezielt verändert worden ist
- Organismus, mit Ausnahme des Menschen, dessen genetisches Material so verändert worden ist, wie es auf natürliche Weise durch Kreuzen und/oder natürliche Rekombination nicht möglich ist
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Welche Kriterien muss bzw. sollte ein für die Gentechnik geeigneter Organismus erfüllen?
- Bekannte Genetik: die Größe und der Aufbau des Genoms sowie die Art der Vermehrung und die Vererbungsformen des betreffenden Organismus müssen bekannt sein
- Leichte Aufnahme von Fremd-DNA: damit ein Organismus als GVO geeignet ist, muss das Einbringen von Fremd-DNA und ihre Integration in das Genom von diesem Organismus möglich sein
- Schnelles Wachstum und Vermehrung: der Organismus sollte schnell wachsen und sich schnell vermehren können, d.h. die Geschlechtsreife (im Fall der sexuellen Vermehrung) früh erreichen, kurze Generationszeiten und eine möglichst lange reproduktive Phase haben
- Nicht pathogen (krankheitserregend) oder toxisch sein: für andere Organismen bzw. für die weitere Verwendung
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Welche Methoden gibt es, um Fremd-DNA in einen Organismus einzubringen (je nach Art dieses Wirtsorganismus)?
- Transformation: bezeichnet die Aufnahme von DNA durch Bakterien (E. coli) und Hefezellen
- Transduktion oder Infektion: bezeichnet den Transfer von DNA in andere Zellen durch Bakteriophagen (transduzieren Bakterien) oder Viren (infizieren eukaryotische Zellen)
- Transfektion: das Einbringen von DNA in eukaryotische (pflanzliche oder tierische) Zellen
- Physikalische (mechanische) Methoden: wie z.B. die Elektroporation = Einbringen von DNA in Bakterien- und eukaryotische Zellen durch Stromstöße, Biolistik = Beschießen eukaryotischer Zellen mit DNA-umhüllten Partikeln, oder Mikroinjektion = Injektion von DNA in den Zellkern oder im Zytoplasma eukaryotische Zellen mittels Mikrokapillaren
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Was zeichnet das Bakterium Escherichia coli als Wirtsorganismus in der Gentechnik aus?
- einfache Kultivierbarkeit
- sehr schnelle Vermehrung (Generationszeit unter optimalen Bedingungen = 20 min)
- bekannte Genetik
- vollständige Kartierung des Genoms
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Wie läuft eine Transformation von E. coli im Labor ab (aus welchen Schritten besteht sie, worauf muss geachtet werden und welche Ziele verfolgt man mit ihr)?
- Aufnahme von Fremd-DNA aus der Umgebung
- E. coli von Natur aus = Transformations-inkompetent
- Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase mit Salzen (CaCl2 oder RbCl) behandeln
- kompetente Zellen mit der zu transformierenden DNA für 30 min auf Eis inkubieren → vermutlich fällt die DNA unter diesen Bedingungen auf der Zelloberfläche aus
- die Zellen für 45 bis 90 sec bei 42°C inkubieren = „Hitzeschock (engl. heat shock)“, was vermutlich die Aufnahme der DNA in die Zellen induziert
- Bakterienzellen für ca. 1 h in Vollmedium ohne Antibiotika inkubieren, damit sie mit der Proteinsynthese (u.a. auch die durch die Antibiotika-Resistenzgene codierten Proteine) beginnen können
- auf Antibiotika-haltigem Selektionsmedium ausplattieren und über Nacht inkubieren → Selektion der Transformanten und Rekombinanten
- DNA wird durch ein DNA-Bindeprotein aktiv an der Oberfläche der Bakterienzelle (Außenwand) gebunden
- ein DNA-Strang wird aktiv in die Bakterienzelle transferiert, der andere DNA-Strang wird durch eine Nuklease abgebaut
- der transferierte DNA-Strang wird im Zytoplasma durch Einzelstrang-Bindeproteine gebunden, u.a. dem RecA-Protein
- das RecA-Protein vermittelt die homologe Rekombination des eingedrungenen DNAStrangs mit homologen Regionen auf dem Bakterienchromosom
- Integration der Fremd-DNA in das Bakteriengenom = die Bakterienzelle ist transformiert
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Welche Arten der Selektion sind nach der Transformation üblich?
- mit einem Antibiotikum werden nur die Zellen selektioniert, die das Plasmid aufgenommen haben = Transformanten (Antibiotikaresistenz ist nur auf dem Plasmid codiert!)
- mit einer Farbreaktion = Blau-Weiß-Selektion werden nur die Zellen selektioniert, die ein rekombinantes Plasmid = Plasmid mit neu eingebauter (ligierter) DNA aufgenommen haben = Rekombinanten (durch die Insertion der DNA wird das unvollständige lacZ‘-Gen, das für einen Teil der β-Galactosidase codiert, unterbrochen = mutiert)
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Welches Prinzip unterliegt einer Selektion nach Antibiotikaresistenz, und auf was wird dabei selektiert?
- Antibiotikaresistenzgene auf den Plasmiden codieren für Proteine = Enzyme, die diese Antibiotika i.d.R. abbauen
- β-Lactam-Antibiotika hemmen die Synthese der bakteriellen Zellwand und wirken bakteriostatisch
- β-Lactamasen spalten den β-Lactam-Ring der Antibiotika und machen sie damit unwirksam
- Andere gängige Antibiotika in der Gentechnik hemmen die Proteinbiosynthese → bakterizide Wirkung
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Welches Prinzip unterliegt der Blau-Weiß-Selektion, und auf was wird dabei selektiert?
- Das unvollständige lacZ‘-Gen auf vielen Plasmiden, das den Polylinker enthält, codiert für einen Teil der β-Galactosidase
- Der restliche Teil der β-Galactosidase wird auf dem Ringchromosom der transformierten Bakterien codiert = α-Komplementation
- Sobald ein DNA-Fragment in den Polylinker inseriert, wird der Leserahmen des lacZ‘-Gens unterbrochen und keine funktionale β-Galactosidase mehr hergestellt
- Blaue Kolonien sind folglich Kolonien, die nur das rezirkularisierte = religierte Plasmid aufgenommen haben
- Weiße Kolonien sind dagegen Kolonien, bei denen das lacZ‘-Gen durch das Insert unterbrochen wurde = Rekombinanten
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Welche gängigen Mutationen wurden in das Genom der heute in der Gentechnik verwendeten E. coli-Stämme eingeführt?
- lacZ-Gen
- Mutationen in z.B. den recA-Genen: die homologe Rekombination der Plasmid-DNA mit dem Bakterienchromosom vermitteln würden
- endoA-Gene: als Endonukleasen die Plasmid-DNA spalten würden
- dam-Gene: die Methylierung der Fremd-DNA vermitteln die Restriktionsendonukleasen inhibieren
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Was ist eine Koloniehybridisierung und wofür wird sie verwendet?
- Replikaplatte = Abklatsch der ursprünglichen Platte wird erstellt
- die Kolonien von dieser Platte auf eine Nylon- oder Nitrozellulosemembran übertragen
- Bakterien auf der Membran werden lysiert, ihre DNA denaturiert und das DNA-Rückgrat kovalent an die Membran durch UV-Strahlung (Nylonmembran) oder Backen bei 80°C (Nitrozellulose) gebunden
- Die einzelsträngige DNA auf der Membran wird mit einer einzelsträngigen und radioaktiv oder anders markierten Sonde hybridisiert nur komplementäre Stränge lagern sich aneinander = hybridisieren
- Die überschüssige Sonde wird weggewaschen
- die Membran einem Film exponiert (radioaktiv markierte Sonde) oder einer Farbreaktion unterzogen (anders markierte Sonden)
- Lage der radioaktiven oder Farbsignale > Identifizierung der rekombinanten Kolonien auf der Originalplatte
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Was ist eine genomische DNA-Bibliothek, und was ist eine cDNABibliothek?
- Genomische DNA-Bibliothek: Sammlungen von DNAFragmenten des kompletten Genoms eines Organismus
- cDNA-Bibliothek: Sammlungen von cDNAFragmenten, die nach reverser Transkription der mRNA eines Organismus oder (wahrscheinlicher) der mRNA eines Gewebes oder Zelle entstanden und in E. coli kloniert worden sind
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Was zeichnet die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Wirtsorganismus in der Gentechnik aus?
- relativ einfache Kultivierbarkeit
- schnelle Vermehrung (Generationszeit unter optimalen Bedingungen = 1,5-2 h)
- bekannte Genetik
- vollständige Kartierung des Genoms
- wenn eukaryotische Zellen benötigt werden, die die mRNA prozessieren und Proteine nach der Translation modifizieren können
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Was ist ein shuttle-Vektor, und auf welchem Prinzip besteht die Selektion bei der Hefe?
können sowohl in Bakterien (E. coli)- als auch Hefezellen vermehrt werden
- auxotrophe Hefestämme werden gezüchtet = Hefezellen, die nur auf Vollmedien und nicht auf Minimalmedien wachsen können
- Die Identifizierung solcher auxotrophen Stämme erfolgte ebenfalls durch Replikaplattierung und Selektion auf Minimalmedium (Agarplatten)
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Wie läuft eine Transformation von S. cerevisiae im Labor ab (aus welchen Schritten besteht sie, und worauf muss geachtet werden)?
- die Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase durch Salzbehandlung (LiAc oder LiCl) kompetent gemacht
- die Zellen werden bei 30°C zusammen mit der zu transformierenden DNA, einer Träger-DNA („carrier“) und einem „Verdichter“ (Polyethylenglykol, PEG) für 30 min – 1 h inkubiert
- einem Hitzeschock bei 42°C für 15 min ausgesetzt
- über ca. 1 h bei 30°C in Vollmedium inkubiert
- sie werden auf Selektiv-Platten mit Minimalmedium für 3-4 Tage bei 30°C inkubiert Selektion der Transformanten und Rekombinanten
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Was ist eine transiente und was eine stabile Hefezelllinie?
- transiente Hefezelllinien: Episome liegen im Zellkern vor und gehen nach einigen Zellteilungen verloren
- stabile Hefezelllinien: integrieren sich stabil ins Hefe-Genom bzw. werden wie ein weiteres Hefe-Chromosom weitervererbt
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