Gentechnik V5

  1. Was ist eine PCR?
    • Polymerase-Kettenreaktion (PCR, von engl. polymerase chain reaction)
    • Eine doppelsträngige DNA-Matrize (template) wird durch eine hitzestabile (wegen der wiederholten Denaturierungsschritte bei hohen Temperaturen) DNA-Polymerase amplifiziert
  2. Wie funktioniert eine PCR?
    • Die Reaktion findet in einem Reaktionsgefäß unter Zugabe der benötigten Primer (DNA-Oligonukleotide, damit die Polymerase an das 3‘-Ende die komplementären Nukleotide hinzufügen kann), dNTPs und Mg-Salze (für das Enzym) statt
    • Während einer PCR wird die durch die Primer eingegrenzte Sequenz exponentiell amplifiziert, da jeweils 2n (n = Anzahl der durchlaufenen Zyklen) PCR-Produkte (Moleküle) entstehen
  3. Was muss beim Primer-Design berücksichtigt werden?
    • Design = Auswahl der Primersequenzen für eine PCR
    • Spezifität der Sequenz für das zu amplifizierende DNAFragment (keine repetitiven oder homologen Sequenzen!)
    • Länge des zu amplifizierenden Fragments (Amplikons, darf nicht zu lang sein)
    • Länge der Primer (Oligonukleotide, i.d.R. zwischen 18 und 22 nt)
    • GC-Gehalt
    • Schmelztemperatur der Primer (sollte für das Primerpaar gleich bis sehr ähnlich sein und zw. 58-62°C liegen)
    • Vorhandensein einer GC-Klemme (eines G oder C-Nukleotids innerhalb der letzten 5 nt am 3‘-Ende der Primer)
    • keine Selbstkomplementarität (komplementäre Sequenzen innerhalb eines Primers oder zwischen dem Primerpaar)
  4. Was sind Polymerasen?
    Enzyme, die die Neusynthese eines DNA- bzw. RNA-Einzelstrangs anhand einer Matrize (engl. template), und somit die Vervielfältigung von DNA bzw. RNA katalysieren
  5. Welche großen Untergruppen (anhand 
    ihrer Eigenschaften) von Polymerasen gibt es?
    • DNAabhängigen DNA- Polymerasen (für die PCR)
    • DNAabhängigen RNA-Polymerasen (für die Neusynthese/Transkription von RNA)
    • RNA-abhängigen DNA-Polymerasen (= reverse Transkriptase, für die cDNA-Synthese)
    • RNAabhängigen RNAPolymerasen (kommen in manchen RNA-Viren vor)
  6. Was sind DNA-Polymerasen und wie funktionieren sie?
    katalysieren die Neusynthese eines DNAEinzelstrangs anhand einer Matrize (engl. template), und somit die Vervielfältigung von DNA. In der PCR werden hitzestabile DNAPolymerasen unterschiedlichen Ursprungs eingesetzt, die die hohen Denaturierungstemperaturen (94°C) überstehen
  7. Welches sind die wichtigsten DNA-Polymerasen in der Gentechnik (mit ihren Besonderheiten)
    • Taq-Polymerase: besitzt keine Korrekturlesefunktion → relativ hohe Fehler- = Mutationsrate aber auch große Schnelligkeit, fügt 3‘-A-Überhange ein → TA-Klonierung
    • Pfu-Polymerase: besitzt eine Korrekturlesefunktion → langsamer, dafür genauer (geringere Fehler- = Mutationsrate)
    • Herculase: eine 30:1-Mischung aus Taq- und PfuPolymerase → produziert 3‘-A-Überhänge und ist genauer
    • Phusion-Polymerase: gentechnisch modifizierte Pfu-Polymerase mit zusätzlicher DNA-Bindungsdomäne → noch schneller und genauer, fällt nicht so leicht von der Matrize ab
  8. Wozu werden PCRs verwendet?
    • kann für die Klonierung genomischer DNA-Sequenzen und RNATranskripte (cDNAs) eingesetzt werden
    • wird z.B. in der klinischen Diagnostik und in der Forensik verwendet.
  9. Welche neueren Methoden gibt es zur Herstellung rekombinanter DNA, und welche wesentlichen Anwendungen haben sie?
    • TA-Klonierung: verwendet den 3‘-A-Überhang nach PCR-Amplifikation eines DNA-Fragments mittels der Taq-Polymerase und einen 3‘-T-Überhang-Vektor → Klonierung ohne Restriktionsenzym!
    • TOPO-TA-Klonierung: verwendet den 3‘-A-Überhang nach PCR-Amplifikation eines DNA-Fragments mittels der Taq-Polymerase und einen 3‘-T-Überhang-Vektor, der mit einer DNA-Topoisomerase behandelt worden ist → Klonierung ohne Restriktionsenzym und ohne Ligation!
    • Golden Gate-Klonierung (nahtlose oder „seamless“ Klonierung): verwendet Typ II-Restriktionsenzyme wie BsaI, BsmBI und BbsI, die etwas außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneiden, zur gleichzeitigen und nahtlosen (da keine Schnittstellen übrig bleiben) Klonierung mehrerer DNA-Fragmente in einen Vektor
    • „Recombineering“: verwendet die durch Integrasen und Exzisionasen vermittelte homologe Rekombination in E. coli oder Hefezellen zur „Austausch-Klonierung“ von DNA-Fragmenten (z.B. Gateway-Klonierung)
Author
Bibi
ID
337798
Card Set
Gentechnik V5
Description
Gentechnik, 5. Vorlesung, 3. Semester
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