Gentechnik V2

Vektoren sind in der Gentechnik DNA-Moleküle mit best. Eigenschaften, die für die Übertragung von rekombinanter DNA auf einen Wirtsorganismus verwendet werden, zum Zweck ihrer Vervielfältigung. Vektoren werden deshalb auch „Genfähren“ genannt.

• Der Vektor muss vom Wirtsorganismus aufgenommen werden können
• Er muss sich innerhalb des Wirtsorganismus vermehren (replizieren) können
• Er muss relativ klein sein, aber relativ große Fremd-DNA-Moleküle aufnehmen können
• Der Vektor muss den Wirtszellen Eigenschaften vermitteln, durch die sie selektierbar werden (um rekombinante von nichtrekombinanten Wirtszellen zu unterscheiden)

• Antibiotikaresistenzen: für die positive Selektion der rekombinanten Zellen, weil sie resistent gegen ein Antibiotikum geworden sind
• Bildung von Toxinen: für die negative Selektion, weil die Toxinbildung die rekombinante Zelle abtötet
• Bildung eines Farbniederschlags durch eine enzymatische Reaktion: Negativselektion, weil die Farbreaktion in rekombinanten Zellen aufgrund der eingetretenen Mutation nicht stattfinden kann

• Plasmide (Bakterien und Hefezellen)
• Virale Vektoren (Bakteriophagen und RNA- bzw- DNA-Viren)
• Phagemide, Cosmide (Bakterien und Bakteriophagen)
• BACs (bacterial artificial chromosomes, Bakterien)
• YACs (yeast artificial chromosomes, Hefezellen)

Plasmide sind kleine, ringförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, die natürlicherweise in Bakterien und Hefezellen vorkommen

• Resistenz (R)-Plasmide: tragen Resistenzgene gegen antibakterielle Wirkstoffe wie Antibiotika oder Schwermetalle
• Fertilitäts (F)-Plasmide: tragen Transfer (tra)-Gene zur Übertragung des Plasmids während der Konjugation
• Colicin (Col)-Plasmide: tragen die antibakteriellen Colicin-Gene von E. coli, deren Proteine andere Bakterien abtöten
• Degradative Plasmide: tragen Gene, deren Proteine organische Subtanzen (Toluol, Salicylsäure) abbauen könnenVirulenzplasmide: tragen Pathogene, die Krankheiten bei anderen (Wirts-) Organismen auslösen können
• Zu den natürlicherweise vorkommenden Hefe- (eukaryotischen) Plasmiden gehören 2-Mikron-Ringe (auch 2-Mikrometer-Ringe genannt): selbstreplizierende, ringförmige DNA-Moleküle mit unbekannter Funktion

• natürlichen Eigenschaften:
• Replikationsstartpunkt (ori bei bakteriellen Plasmiden, ASR bei 2-Mikron-Ringen)
• Antibiotikaresistenzen
• Zusätzlich:
• Polylinker (engl. multiple cloning site, MCS) für die gezielte Einfügung von Fremd-DNA
• Selektionsmarker (z.B. (unvollständige) bakterielle oder Hefe-Enzyme)
• Gensequenzen aus dem bakteriellen Chromosom (z.B. das lacI-Gen, das den LacI-Repressor codiert)
• nicht benötigte Sequenzen wurden entfernt (→ Verkleinerung der Plasmidgröße)
• Hefe-Plasmide wurden meist aus bakteriellen Plasmid- und 2-MikronRing-Anteilen zusammengesetzt, um sie auch in Bakterien (E. coli) vermehren und selektieren zu können = shuttle-Vektoren

• Reine Klonierungsvektoren: dienen einzig der Klonierung eines fremden DNA-Fragments, besitzen einen Replikationsstartpunkt (ori), eine oder mehrere Antibiotikaresistenzen, einen Polylinker, der ggf. in das lacZ‘Gen (für die Blau-Weiß-Selektion) inseriert wurde
• Expressionsvektoren: dienen neben der Klonierung auch der Expression = Transkription und ggf. Translation des klonierten DNA-Fragments. Sie besitzen zusätzlich zu den Eigenschaften eines Klonierungsvektors (s.o.) einen bakteriellen oder HefePromotor mit einem Transkriptions- und ggf. Translationsstart (Ribosomenbindungsstelle), ein Terminationssignal (Terminator) und meist auch das lacI-Gen (codiert den LacIRepressor) zur Induktion der Proteinexpression

• Die Anzahl der Plasmid-Kopien pro Zelle → DNA-Menge, die gewonnen werden kann: es werden „high copy number“ Plasmide (50 – 1000 Kopien pro Zelle) von „low copy number“ Plasmiden (1-5 Kopien pro Zelle) unterschieden
• Größe der klonierbaren Fremd-DNA (rekombinanter DNA): in der Regel kann ein Plasmid insgesamt nicht größer als 10 bis 20 kb sein, weil es sonst instabil wird bzw. während der Isolierung zerfällt